現(xiàn)有抗生素很難根治慢性細(xì)菌感染，主要原因是原本對(duì)抗生素敏感的致病菌進(jìn)入了休眠狀態(tài)。這些休眠的細(xì)菌被稱作“持留菌”，除了保存實(shí)力等待死灰復(fù)燃的再次感染機(jī)會(huì)以外，并不表現(xiàn)任何生命特征。因此，對(duì)通過抑制活躍致病菌的特定靶標(biāo)功能實(shí)現(xiàn)殺菌或者抑菌的抗生素并不敏感。天然產(chǎn)物ADEPs通過激動(dòng)ClpP蛋白酶的水解活性，非選擇性降解細(xì)菌分裂蛋白FtsZ等，與利福平聯(lián)用可以有效清除持留菌。這個(gè)特點(diǎn)賦予了化學(xué)小分子激動(dòng)ClpP蛋白酶清除持留菌的邏輯可行性。然而，激動(dòng)ClpP水解功能的分子基礎(chǔ)還有待深入探索。
中國科學(xué)院上海藥物研究所楊財(cái)廣課題組前期合作研究描述了金黃色葡萄球菌ClpP蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)以及分子動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)（J. Biol. Chem. 2013, 288, 17643-17653; J. Biol. Chem. 2011, 286, 37590-37601）。該研究成功設(shè)計(jì)并充分表征了具有功能獲得性自激活的ClpP突變體ClpPN42AY63A，從分子機(jī)制和表型上，突變體的特征與ADEP紊亂激動(dòng)ClpP水解酶的特征極其相似。首先研究表征了突變體蛋白質(zhì)的生化活性、聚集狀態(tài)及熱穩(wěn)定性，揭示Tyr63對(duì)于ClpP功能激動(dòng)起到啟動(dòng)開關(guān)的作用。其次，解析了ClpPY63A突變體的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)具有多米諾效應(yīng)的Asn42在功能激動(dòng)中發(fā)揮促進(jìn)增強(qiáng)的作用。
利用冷凍電鏡技術(shù)展示ClpPY63AN42A的N端底物入口的口徑變大，是實(shí)現(xiàn)功能激活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。利用掃描電鏡實(shí)驗(yàn)確證了表達(dá)ClpPY63AN42A突變體的菌株生長(zhǎng)緩慢是由于分裂蛋白FtsZ被降解，表現(xiàn)出金黃色葡萄球菌個(gè)體變大的表型，該結(jié)果也為評(píng)價(jià)ClpP小分子激動(dòng)劑的表型研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。最后，由周虎課題組利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)ClpPY63AN42A的突變體菌株中有500多個(gè)蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了顯著性改變，尤其是FtsZ等蛋白質(zhì)顯著減少，與ADEP處理的野生菌株的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果一致。
該研究構(gòu)建獲得了具有非特異性自激活的ClpP突變水解體系，深入描述了ClpP功能激活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制，奠定了基于ClpP結(jié)構(gòu)和功能發(fā)展小分子激動(dòng)劑控制持留菌感染的基礎(chǔ)。
該研究得到了浙江理工大學(xué)、上海光源、蛋白質(zhì)設(shè)施、上海中醫(yī)藥大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)以及上海藥物所等合作課題組的大力支持，獲得了國家自然科學(xué)基金、上海藥物所自主部署項(xiàng)目等資助。研究成果于2016年5月在線發(fā)表于美國化學(xué)會(huì)化學(xué)生物學(xué)期刊ACS Chemical Biology上。
ClpP功能獲得性突變體的作用示意圖
