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本發(fā)明通常涉及生物技術(shù)，尤其涉及基因表達調(diào)控、基因治療和醫(yī)藥。更具體地，本文公開了工程化的肝臟特異性增強子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、重組aav(raav)載體通常通過用目的基因替換腺相關(guān)病毒(aav)的病毒編碼序列來產(chǎn)生。raav載體被認為是最有希望治療遺傳性疾病的病毒載體。然而，raav的包裝容量有限，小于5.0kb。如果目的基因的大小大于5.0kb，raav載體就無法完全包裝在aav衣殼中，因此無法有效的用于基因治療。
2、raav載體通常由治療基因的表達盒和兩個itr組成。表達盒包括啟動子、目的基因(轉(zhuǎn)基因)和polya序列。目前可用的最短多聚腺苷酸序列約為50bp。兩個itr位于表達盒的兩端，每個itr長145bp，它們是必須摻入raav載體中的包裝信號。因此，治療基因表達盒的長度空間約為4.71kb。
3、一些編碼治療基因的dna片段對于raav包裝能力而言尺寸過大。為了使表達盒保持在有效包裝的范圍內(nèi)，啟動子的小尺寸很重要。此外，如果啟動子是肝臟特異性的并能驅(qū)動較強的基因表達，這可以確保治療的安全性和效率，因為大量注射raav載體可能會導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)。從這個意義上說，人們迫切需要短的、強的肝臟特異性啟動子，用于血友病a的raav基因治療。
4、另外，雖然一些編碼治療基因的dna片段足夠小以進行有效包裝，但相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性較低，因此需要將大量的raav載體注射到患者體內(nèi)以產(chǎn)生足夠的相應(yīng)蛋白質(zhì)。大量注射raav載體可能會導(dǎo)致不良的免疫反應(yīng)。因此，需要開發(fā)有效的特異性啟動子和增強子來增強治療基因的活性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了工程化的肝臟特異性增強子、包括該增強子的合成啟動子、含有該合成啟動子的表達載體、以及使用其來滿足本領(lǐng)域的需要，例如治療各種遺傳疾病或病癥。
2、一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合位點的工程化增強子，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由hnf-4α、hnf-3β、d位點結(jié)合蛋白(dbp)、ccaat增強子結(jié)合蛋白alpha/beta(c/ebp-α/β)和肝細胞核因子1alpha/beta(hnf-1α/β)。
3、在一些實施方案中，hnf-4α、hnf-3β、dbp、c/ebp-α/β和hnf-1α/β的dna結(jié)合位點分別包含seq?id?no:4-8的核苷酸序列。
4、在一些實施方案中，工程化的增強子包含seq?id?no:3、seq?id?no:9、seq?id?no:12的核酸序列，或核酸序列與seq?id?no:3、9或12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
5、另一方面，本發(fā)明提供了包含本文公開的工程化增強子和核心啟動子的核酸序列的合成啟動子。
6、在一些實施方案中，核心啟動子是肝臟特異性啟動子。
7、在一些實施方案中，肝臟特異性啟動子是人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動子。
8、在一些實施方案中，人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動子包含seq?id?no:1、seq?idno:2的核酸序列，或與seq?id?no：1或2的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
9、在一些實施方案中，合成啟動子包含seq?id?no:10、seq?id?no:13、seq?id?no:14，或核酸序列與seq?id?no：10、13或14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
10、另一方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含本文公開的合成啟動子可操作地連接至目的基因。在一些實施方案中，表達載體是質(zhì)粒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體或重組腺相關(guān)病毒載體(raav)。
11、另一方面，本發(fā)明提供了治療有需要的受試者的遺傳疾病或病癥的方法，包括向受試者施用本文公開的表達載體，從而在受試者的肝臟中表達治療性蛋白。
12、在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，受試者是人類。
13、在一些實施方案中，與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥選自包括但不限于遺傳性膽汁淤積癥、a型血友病、b型血友病、苯丙酮尿癥、遺傳性血色素沉著病、1型酪氨酸血癥、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、精氨基琥珀酸尿癥、肝癌、糖原貯積病、尿素循環(huán)障礙、克里格勒-納賈爾綜合征、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、非典型溶血性尿毒癥綜合征-1、原發(fā)性高草酸尿癥1型、楓糖漿尿病、急性間歇性卟啉癥、凝血缺陷、糖原累積病1a型、純合子家族性高膽固醇血癥、有機酸尿癥、囊性纖維化、紅細胞生成性原卟啉癥、戈謝病、家族性高膽固醇血癥、鳥氨酸和轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。
14、另一方面，本發(fā)明提供工程化增強子、或合成啟動子、或表達載體在增強肝細胞中轉(zhuǎn)基因的表達水平中的用途。
15、另一方面，本發(fā)明提供工程化增強子、或合成啟動子、或表達載體、或藥物組合物在制備用于與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的藥物中的用途。
16、另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開的工程化增強子、或合成啟動子、或表達載體、或藥物組合物的試劑盒。
17、在一些實施例中，試劑盒還包含使用試劑盒的說明書。
18、參考以下描述和所附權(quán)利要求將更好地理解本發(fā)明的這些和其他特征、方面和優(yōu)點。
1.一種工程化增強子，其包含一個或多個轉(zhuǎn)錄因子的dna結(jié)合位點，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由hnf-4α、hnf-3β、d位點結(jié)合蛋白(dbp)、ccaat增強子結(jié)合蛋白α/β(c/ebp-α/β)和肝細胞核因子1α/β(hnf-1α/β)組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的工程化增強子，其中hnf-4α、hnf-3β、dbp、c/ebp-α/β和hnf-1α/β的dna結(jié)合位點分別包含seq?id?no：4-8的核酸序列。
3.權(quán)利要求1-2中任一項所述的工程化增強子，其中所述工程化增強子包含與seq?idno：3、9或12的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。
4.一種合成啟動子，其包含權(quán)利要求1-3中任一項所述的工程化增強子和核心啟動子的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成啟動子，其中所述核心啟動子是肝臟特異性啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成啟動子，其中所述肝臟特異性啟動子是人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成啟動子，其中所述人α-1抗胰蛋白酶(haat)啟動子包含與seq?id?no：1或2的核酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項所述的合成啟動子，其中所述合成啟動子包含與seq?idno:10、13或14的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
9.一種表達載體，其包含權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達載體，其還包含可操作地連接到權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子的轉(zhuǎn)基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達載體，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼用于治療與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的治療性蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的表達載體，其中所述治療性蛋白是fⅷ蛋白或其功能片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項所述的表達載體，其中所述表達載體是質(zhì)粒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體或重組腺相關(guān)病毒載體(raav)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的表達載體，其中所述表達載體是raav載體。
15.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項所述的工程化增強子、或權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子、或權(quán)利要求9-14中任一項所述的表達載體，以及藥學上可接受的載體。
16.一種治療有需要的受試者的與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求9-14任一項所述的表達載體或權(quán)利要求15所述的藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述受試者是人類。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的與肝臟相關(guān)的遺傳疾病或病癥選自包括但不限于遺傳性膽汁淤積癥、a型血友病、b型血友病、苯丙酮尿癥、遺傳性血色素沉著病、1型酪氨酸血癥、α-1型抗胰蛋白酶缺乏癥、精氨酸琥珀酸尿癥、肝癌、糖原貯積癥、尿素循環(huán)障礙、克里格勒-納賈爾綜合征、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、非典型溶血性尿毒癥綜合征-1、原發(fā)性高草酸尿癥1型、楓糖漿尿病、急性間歇性卟啉癥、凝血缺陷、糖原累積病a型、純合子家族性高膽固醇血癥、有機酸尿癥、囊性纖維化、紅細胞生成性原卟啉癥、戈謝病、家族性高膽固醇血癥、鳥氨酸和轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的工程化增強子、或權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子、或權(quán)利要求9-14中任一項的表達載體在增強肝細胞中轉(zhuǎn)基因的表達水平中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因與所述合成啟動子可操作地連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的工程化增強子、或權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子、或權(quán)利要求9-14中任一項的表達載體、或權(quán)利要求15的藥物組合物在制備用于與肝臟相關(guān)的遺傳性疾病或病癥的藥物中的用途。
22.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求4-8中任一項所述的合成啟動子、或權(quán)利要求9-14中任一項所述的表達載體、或權(quán)利要求15所述的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其進一步包括使用所述試劑盒的說明書。