專利名稱：：用于遞送抗病毒肽治療劑的新制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了組合物及將其作為治療劑進(jìn)行施用的方法。尤其是，本發(fā)明提供了組合物及其在施用生物活性分子例如抗病毒肽治療劑中的用途。
背景技術(shù)：
：肽遞送系統(tǒng)這樣的肽產(chǎn)品屬于各種類別，例如，舉例來說，激素、酶和免疫調(diào)節(jié)劑(例如抗體、血清蛋白和細(xì)胞因子)。對于在患者體內(nèi)表現(xiàn)出恰當(dāng)?shù)纳飳W(xué)和治療效果的肽，它們必須以適當(dāng)?shù)臐舛却嬖谟隗w內(nèi)作用位點(diǎn)。更具體地，任何特定化合物(包括任何特定肽)的藥代動力學(xué)依賴于該化合物在體內(nèi)的生物利用度、分布和清除率。然而，肽的化學(xué)性質(zhì)和特性，例如大小、復(fù)雜性、構(gòu)象要求和溶解度性質(zhì)，易于使肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)不如其它化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)理想。因此，本領(lǐng)域有大量工作致力于開發(fā)施用治療劑例如肽的方法，以增加該治療劑的生物利用度和半衰期。雖然在這方面已經(jīng)有所進(jìn)展，本領(lǐng)域仍然需要可用于以理想的藥代動力學(xué)性質(zhì)遞送肽治療劑的另外的組合物。本發(fā)明提供的組合物和方法解決了這些需求
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了組合物，該組合物例如可被用于向患者施用生物活性分子。具體地，本發(fā)明提供了包含溶劑、膠凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的組合物。不受理論的限制，本發(fā)明提供的實(shí)施方案至少部分地基于意外的發(fā)現(xiàn)，即可以在組合物向個(gè)體施用顯示理想的藥代動力學(xué)性質(zhì)的同時(shí)，在組合物中提高所包含的生物活性分子的重量百分比。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)施用于患者后，本發(fā)明提供的組合物產(chǎn)生的生物分子血漿濃度迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小時(shí)內(nèi))達(dá)到Cm狀并在5、7、10、14、17、21或28天或更長時(shí)間中提供該生物分子的相對恒定的血漿濃度。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物的理想藥代動力學(xué)性質(zhì)為更低的Cmax、更長的tmax和更長的t0.01或to.,。本發(fā)明提供的組合物例如可用于施用包含某些抗病毒肽的組合物，所述抗病毒肽被稱為T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和Tl144(SEQIDNO:9)、或者兩個(gè)或多個(gè)上述肽的組合，以及T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和T1144(SEQIDNO:9)各肽的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含溶劑、通過溶劑-皮下液體交換形成基質(zhì)的膠凝材料、以及至少一種生物活性分子，例如抗病毒肽，例如T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和T1144(SEQIDNO:9)、或上述肽的衍生物。在另一實(shí)施方案中，這些組合物進(jìn)一步包含至少一種額外的成分，例如藥學(xué)可接受載體、大分子、或其組合。在另一實(shí)施方案中，這些組合物除了以上列舉的抗病毒肽之外可進(jìn)一步包含抗病毒劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用本發(fā)明提供的組合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物被用作治療方案例如抗病毒治療方案的一部分。在某些實(shí)施方案中，這樣的治療方案可以，例如，被用于治療HIV感染，例如fflV-l感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明提供的組合物抑制HIV向靶細(xì)胞傳遞的方法，所述方法包含向患者施用一定量的本發(fā)明提供的組合物，以使所述靶細(xì)胞與一定量的有效抑制細(xì)胞被病毒感染的活性劑(例如抗病毒肽和/或另一抗病毒劑)接觸。本發(fā)明還提供了治療fflv感染(在一個(gè)實(shí)施方案中，mv-i感染)的方法，所述方法包含向HIV感染的患者施用治療fflV感染的有效量的本發(fā)明提供的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用包含有效量的生物活性分子(例如抗病毒肽)的組合物制備用于治療HIV感染的藥物(例如用于抑制fflv傳遞的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治療或抑制fflV感染的方法)的方法。結(jié)合附圖，本發(fā)明提供的組合物和方法的上述和其它目標(biāo)、特征、和益處將在以下詳細(xì)說明中清晰呈現(xiàn)。圖1為fflV-lgp41的示意圖，顯示了gp41的七個(gè)氨基酸重復(fù)區(qū)域l(HR1)和七個(gè)氨基酸重復(fù)區(qū)域2(HR2)以及其它功能區(qū)，所述HR2包括熟知的亮氨酸拉鏈樣基序INNYTSLI。為了說明的目的，相對于HIVmB毒抹的gpl60,顯示了對應(yīng)于HR1和HR2的示例性天然氨基酸序列和氨基酸位點(diǎn)編號。為了說明而非限制的目的，圖2顯示了由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室毒抹和臨床分離抹確定的HIV-lgp41的HR2區(qū)域內(nèi)包含的天然氨基酸序列的比較，其中以單字母氨基酸編碼表示，顯示了氨基酸序列中的某些變異(例如多態(tài)性)。為示例目的，與最上方分離抹序列中氨基酸序列INNYTSLI比對的分離抹序列對應(yīng)于HR2亮氨酸拉鏈樣基序。圖3為顯示fflV融合抑制肽SEQIDNO:9合成的示意圖，所述fflV融合抑制肽具有SEQIDNO:9的氨基酸序列，所述合成使用涉及3種肽片段組裝的片段縮合法。圖4為顯示HIV融合抑制肽SEQIDNO:9合成的示意圖，所述HIV融合抑制肽具有SEQIDNO:9的氨基酸序列，所述合成使用涉及2種肽片段組裝的片段縮合法。圖5顯示了在通過以下組合物施用T1144后的432小時(shí)中獼猴體內(nèi)的T1144血漿濃度圖用ZnS04溶液沉淀的T1144(89乂肽)在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中形成的100mg/g懸浮液，1000—);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(60%肽)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400■—)。圖6顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖用ZnS04溶液沉淀的T1144(89^肽)在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(60^肽)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400■—)。圖7顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89^肽，2%鋅)在80:0:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89o/o肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(89%肽，2%鋅)在65:15:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^1(—▲—)。圖8顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(~);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73^肽，2%鋅)在85:0:15的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400pl(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73X肽，2%鋅)在74:11:15的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—)。圖9顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200(xl(~~);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73^肽，2%鋅)在70:10:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^1(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73^肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400■—)。圖10顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200^1(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73X肽，2%鋅)在70:10:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，柳nl(-誦—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73X肽，2%鋅)在74:11:15的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—)。圖11顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200[xl(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73^肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:三乙酸甘油酯中形成的50mg/g懸浮液，400p1(——);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)12在75:5:20的SAIB:PLA3M:苯甲酸千酯中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400jxl(-國▲—)。圖12顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73^肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400nl(-—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73乂肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的75mg/g懸浮液，400p1(—羅—)；用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400|^1(—▲—)。圖13顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(88X肽，2%鋅)在77:15:8的SAIB:NMP:乙醇中形成的50mg/g懸浮液，400n1(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(88^肽，2%鋅)在77:15:8的SAIB:NMP:乙醇中形成的100mg/g懸浮液，200p1(—■—);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(73%肽，2%鋅)在74:11:15的SAIB:PLA3M:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400pl(國-0—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73。/。肽，2%鋅)在74:11:15的SAIB:PLA3M:NMP中形成的100mg/g懸浮液，200p1(—□—)。圖14顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200nl(—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(89%肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^1(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89X肽，2%鋅)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—)。圖15顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200|xl(—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73X)在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400W(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89Q/^)在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^1(—■—);用ZnS04溶液沉淀(73%)并在ZnS04溶液中制漿(70%)的T1144在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400|_il(—▲—);噴霧干燥(89Q/。)并在ZnS04溶液中制漿(66Q/)的T1144在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400o—);用ZnS04溶液沉淀(88%)并在ZnS04溶液中制漿(71%)的T1144在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400I—);噴霧干燥(89%)并在ZnS04溶液中懸浮(65X)的T1144在75:5:20的SAIB:PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400x—)。圖16顯示了在通過以下組合物施用T1144后的432小時(shí)中猴體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3.5mg/mLT1144溶液，800pl(—);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(89%)在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400W(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89W)在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400■—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89%)在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中形成的100mg/g懸浮液，1000p1(—▲—)。圖17顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—-);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(89%肽，2%鋅)在40:60的PLGA1A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(89^肽，2%鋅)在60:40的PLGA1A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—■—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(88%肽，2%鋅)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400Hl(—▲—)。圖18顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)在50:50的PLGA1A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(——);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(73%肽，2%鋅)在40:60的PLGA1A:三乙酸甘油酯中形成的50mg/g懸浮液，400■—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73X肽，2%鋅)在40:60的PLGA3A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400^d(—▲—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(73%肽，2%鋅)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(—。—)。圖19顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)在50:50的PLGA1A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(73%肽，2%鋅)在50:50的PLGA1A:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400^1(—■—);用ZnS04溶液沉淀的丁1144(91%肽，2%鋅)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400p1(——);用ZnS04溶液沉淀的T1144(91%肽，2%鋅)在40:60的PLA3L:NMP中形成的100mg/g懸浮液，400n1(—□—);用ZnS04溶液沉淀的T1144(90^肽，2%鋅)在40:60的PLA3L:NMP中形成的200mg/g懸浮液，400p1(—△—)。圖20顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pl(—);噴霧干燥制備的T1144在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400—);在甲醇中pH沉淀的丁1144(88%肽)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400疆—)。圖21顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200|xl(—);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(60%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400—);洗滌過的Tl144(94%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400■—);用ZnS04溶液沉淀的Tl144(88%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400▲—);從甲醇/水中沉淀出的Tl144(91%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400o—)。圖22顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中大鼠體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200nl(~);用CaCl2溶液沉淀的Tl144(29%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400—);用CaCl2溶液沉淀的Tl144(53%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400■—);用FeS04溶液沉淀的T1144(88^)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400▲—);用FeS04溶液沉淀的T1144(91%)在40:60的PLA3L:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400o—)。圖23顯示了在通過以下組合物施用T1144后的432小時(shí)中猴體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3.5mg/mLT1144溶液，800pi(—);用鋅溶液沉淀的T1144(89^)在40:60的PLGA1A:NMP中形成的50mg/g懸浮液，400—);液，400pl(畫誦B國畫)。圖24顯示了在通過以下組合物施用T1144后的168小時(shí)中猴體內(nèi)的T1144血漿濃度圖3mg/mLT1144溶液，1200pi(—);沉淀H在40:60的PLA3L:NMP中的懸浮液，400□—);沉淀J在40:60的PLA3L:NMP中的懸浮液，400—);沉淀M在40:60的PLA3L:NMP中的懸浮液，400—);沉淀N在40:60的PLA3L:NMP中的懸浮液，400p1(—■—)。詳細(xì)說明定義當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"患者"指哺乳動物，例如人。在具體實(shí)施方案中，"患者"是需要本發(fā)明公開的疾病或病癥(例如fflV或艾滋病)治療的哺乳動物，例如人。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"靶細(xì)胞"指能夠被mv感染的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為人細(xì)胞；在另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是能夠通過包括膜融合的過程被HIV感染的人細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞存在于患者例如人患者體內(nèi)。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"組合物"指包含溶劑、膠凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的制劑。本文描述了示例性組合物。本文提供的組合物可以例如被用作藥物或用于制備藥物。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"溶劑"指可與水混溶的液體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑是可與水混溶的液體并與助溶劑例如NMP組合使用。溶劑可被用于，例如，充分稀釋膠凝材料以允許注射入患者體內(nèi)。本發(fā)明描述了示例性溶劑，所述示例性溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"膠凝材料"指可與溶劑混溶的材料，所述材料當(dāng)存在于包含溶劑和膠凝材料的組合物中時(shí)，通過溶劑-皮下液體交換(即溶劑-皮下患者液體交換)形成基質(zhì)。本發(fā)明描述了示例性膠凝材料，所述示例性膠凝材料為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。17當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"基質(zhì)"指在溶劑-皮下液體交換后膠凝材料呈現(xiàn)的可生物降解或可生物侵蝕的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)為粘性(即抗剪切)基質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，所述基質(zhì)為凝膠。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"運(yùn)載體"指可用于向患者遞送生物活性分子(例如肽，例如抗病毒肽)的包含溶劑和膠凝材料的液體材料。運(yùn)載體可以以水性狀態(tài)存儲。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"藥學(xué)可接受的載體"指-陂添加到活性成分(例如HIV融合抑制肽)中而并不顯著改變所述活性成分的生物學(xué)活性的載體介質(zhì)。藥學(xué)可接受的載體包括但不限于以下的一種或多種物質(zhì)水、緩沖水、鹽水、0.3%甘氨酸、水性醇、等滲水性溶液；并可進(jìn)一步包括一種或多種物質(zhì)，例如甘油、油類、鹽類(例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和銨鹽)、磷酸鹽、碳酸酯、脂肪酸、糖類(例如甘露醇)、多糖、聚合物、賦形劑、和防腐劑和/或穩(wěn)定劑(用于延長保質(zhì)期或?yàn)榻M合物生產(chǎn)和銷售所必需且適合的)。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)可接受載體適于肌肉內(nèi)、皮下或腸胃外施用。除非另外特別指出，在用于本說明書和權(quán)利要求書并涉及HIV融合抑制肽時(shí)，術(shù)語"包含異亮氨酸或亮氨酸的氨基酸"分別指異亮氨酸或亮氨酸，或所述它們相應(yīng)的天然存在的氨基酸(例如L-氨基酸)、非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)、異構(gòu)體形式(例如正亮氨酸、別異亮氨酸等)、或衍生物形式(例如叔亮氨酸)。異亮氨酸或亮氨酸氨基酸的一種形式可用于排除所述氨基酸的其它形式。本文所述的fflV融合抑制肽還可在其氨基酸序列中包含源自HIVgp41HR2區(qū)域序列的一種或多種多態(tài)性(參見，例如圖2)，除了在本發(fā)明教導(dǎo)的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)包括包含異亮氨酸或亮氨酸的氨基酸。術(shù)語"fflV"指人類免疫缺陷病毒，在一個(gè)實(shí)施方案中，指fflV-l。術(shù)語"分離的"在用于生物活性分子(例如抗病毒肽如fflV融合抑制肽、或肽片段)時(shí)，指所述生物活性分子基本不含未成為該生物分子自身整體結(jié)構(gòu)的一部分的成分，例如，在使用生物、生物化學(xué)、或化學(xué)方法合成、制備、或修飾時(shí)，基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。在某些實(shí)施方案中，分離的生物活性分子純度超過大約75%、80%、85%、卯％、95%、97%、99%或99.9%重量。在用于fflV融合抑制肽時(shí)，術(shù)語"1到3個(gè)氨基酸替換"指fflV融合抑制肽還是具有SEQIDNO:9-15中任一序列的氨基酸序列，但是與SEQIDNO:9-15中任一序列相比具有不少于1個(gè)且不多于3個(gè)氨基酸差異；同時(shí)還具有(a)多于一個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序和除了形成亮氨酸拉鏈樣基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨酸拉鏈樣基序的1或8位點(diǎn)以外)的至少一個(gè)額外的亮氨酸，或(b)3到5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序；并具有抗HIV的抗病毒活性(抑制fflV介導(dǎo)的融合的活性)。在此方面，具有替換(當(dāng)與SEQIDNO:9-15相比時(shí))的fflV融合抑制肽的氨基酸差異位于除本發(fā)明的fflV融合抑制肽標(biāo)示為亮氨酸和/或異亮氨酸殘基以外的氨基酸序列位點(diǎn)(參見，例如本發(fā)明圖示(i)和(n))。所述不少于1個(gè)且不多于3個(gè)氨基酸差異包括，但不限于，保守氨基酸替換(本領(lǐng)域已知包括與被替換氨基酸具有基本相同的電荷、大小、親水性、和/或芳香性的氨基酸替換；實(shí)例包括，但不限于，甘氨酸-丙氨酸-纈氨酸、色氨酸-酪氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-賴氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺、和絲氨酸-蘇氨酸)和/或多態(tài)性(例如，如圖2所示，或如在實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的、多種分化枝、和/或HIV-l的臨床分離抹)。例如，對于SEQIDNO:11、12、或13，fflV融合抑制肽具有1到3個(gè)氨基酸差異，所述氨基酸差異位于SEQIDNO:11、12、或13中任一序列的氨基酸殘基10、17、24、31、和38以外的^f立點(diǎn)。例如，對于SEQIDNO:9和SEQIDNO:14，HIV融合抑制狀具有1到3個(gè)氨基酸差異，所述氨基酸差異位于SEQIDNO:9或SEQIDNO:14的氨基酸殘基10、17、21、24、和38以外的位點(diǎn)。例如，對于SEQIDNO:10或SEQIDNO:15，HIV融合抑制肽具有1到3個(gè)氨基酸差異，所述氨基酸差異位于SEQIDNO:10或SEQIDNO:15的氨基酸殘基10、17、21、31、和38以外的位點(diǎn)。所述實(shí)施方案的示例性例子包括但不限于SEQIDNO:16的氨基酸序列，其中可能是1到3個(gè)氨基酸替換的氨基酸差異位點(diǎn)用Xaa標(biāo)示(表示天然或非天然存在的任何氨基酸，即多于一種可能的氨基酸可用于此氨基酸位點(diǎn))。同樣地，可產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替換，例如用精氨酸或組氨酸替換賴氨酸、用賴氨酸或組氨酸替換精氨酸、用天冬氨酸替換谷氨酸、或用谷氨酸替換天冬氨酸。為示意目的，氨基酸位點(diǎn)IO、17、21、24、31、和38用下劃線標(biāo)示。同樣對于SEQIDNO:9-15,應(yīng)注意在SEQIDNO:16中"Zaa"用于標(biāo)示可能為亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸；并且Baa用于標(biāo)示優(yōu)選為亮氨酸、異亮氨酸，但可能為Xaa的氨基酸，但是至少一個(gè)Baa為亮氨酸或異亮氨酸。SEQIDNO:16:XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa本發(fā)明所述的HIV融合抑制肽也可以，例如，包括對應(yīng)于SEQIDNO:5的HIVgp41HR2區(qū)域衍生的肽(通過序列比對)，所述肽存在于HIV-1的實(shí)驗(yàn)室抹、分化枝或臨床分離抹中，例如圖2中所列的實(shí)驗(yàn)室毒林和臨床分離抹，只要所述HIV融合抑制肽滿足SEQIDNO:16的氨基酸要求。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些fflV融合抑制肽與SEQIDNO:9-15中任一序列相比，顯示出1到3個(gè)氨基酸替換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽進(jìn)一步包含N20末端封閉基團(tuán)或C末端封閉基團(tuán)，或上述兩者；且所述末端基團(tuán)可包括，但不限于位于N末端的氨基或乙?；?；位于C末端的羧基或酰胺基。本發(fā)明所述的HIV融合抑制肽也可包括顯示出美國專利US酸序列的肽，只要所述fflV融合抑制肽滿足SEQIDNO:16的氨基酸要求。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類fflV融合抑制肽與SEQIDNO:9-15中任一序列相比，顯示出1到3個(gè)氨基酸替換。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HIV融合抑制肽的長度為14到60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽進(jìn)一步包含N末端封閉基團(tuán)或C末端封閉基團(tuán)，或上述兩者；且所述末端基團(tuán)可包括但不限于位于N末端的氨基或乙?；晃挥贑末端的羧基或酰胺基。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"反應(yīng)性官能團(tuán)"指能夠與另一化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分形成化學(xué)鍵的化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分。關(guān)于化學(xué)基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，反應(yīng)性官能團(tuán)包含的基團(tuán)包括但不限于，馬來酰亞胺、巰基、羧酸、氫、磷?；?、?；?、羥基、乙?；?、疏水基團(tuán)、胺、酰胺基、丹磺?；⒒腔?、琥珀酰亞胺、巰基反應(yīng)性基團(tuán)、胺反應(yīng)性基團(tuán)、羧基反應(yīng)性基團(tuán)等。一種反應(yīng)性官能團(tuán)可用于排除另一反應(yīng)性官能團(tuán)。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"接頭"指作為分子橋以可操作地連接兩個(gè)不同分子的化合物或部分(例如，接頭的第一個(gè)反應(yīng)性官能團(tuán)共價(jià)連接到大分子載體的反應(yīng)性官能團(tuán)，且該接頭的第二個(gè)反應(yīng)性官能團(tuán)共價(jià)連接到fflV融合抑制肽的反應(yīng)性官能團(tuán))。在包含fflV融合抑制肽的一個(gè)或多個(gè)拷貝的重組融合蛋白的制備中，接頭可以是氨基酸。或者，兩個(gè)不同分子可以以分步的方式(例如通過化學(xué)偶合)連接到接頭上。一般而言，對于接頭，沒有特定的大小或成分限制，只要所述接頭可滿足作為分子橋的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，接頭包括但不限于，化學(xué)鏈、化合物(例如試劑)、氨基酸等。接頭可包括但不限于，同雙功能接頭、異雙功能接頭、生物穩(wěn)定接頭、可水解接頭、和可生物降解接頭，以及本領(lǐng)域已知的其它接頭。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，異雙功能接頭包含具有第一反應(yīng)性官能團(tuán)從而特異性連接第一分子的一端，和具有第二反應(yīng)性官能團(tuán)從而特異性連接第二分子的相對端。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，多種單功能、雙功能、和多功能試劑(例如PierceChemicalCo.,Rockford,III目錄中所述的試劑)可被用作接頭。根據(jù)例如待被連接的分子、進(jìn)行連接的條件、和施用時(shí)期望的藥代動力學(xué)性質(zhì)等因素，所述接頭的長度和組成可以改變以優(yōu)化例如以下性質(zhì)生物活性和功能的保持、穩(wěn)定性、對某種化學(xué)品和/或溫度參數(shù)的抗性、在體內(nèi)對裂解的敏感性、以及足夠的立體選擇性或大小。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"大分子載體"指連接、加入、或融合(例如，以化學(xué)方法，或通過使用遺傳表達(dá)的重組方法)至本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)肽的分子，由此與不存在所述分子時(shí)的所述一個(gè)或多個(gè)肽相比，所述分子能夠賦予所述一個(gè)或多個(gè)肽一種或多種以下性質(zhì)穩(wěn)定性、生物活性的增強(qiáng)、血漿半衰期的延長(例如延長所述一個(gè)或多個(gè)肽在體內(nèi)的持久性)。本領(lǐng)域熟知，這些大分子載體包括但不限于，血清蛋白、聚合物、碳水化合物、和脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物。典型地用作大分子載體的血清蛋白包括但不限于，轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白(優(yōu)選人白蛋白)、免疫球蛋白(優(yōu)選人IgG或其一條或多條鏈)、或激素。典型地用作大分子載體的聚合物包括但不限于，聚賴氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-賴氨酸)、或多元醇。多元醇可包含水溶性聚(環(huán)氧烷烴)聚合物，且可具有直鏈或支鏈。聚合物可為支鏈多元醇(例如PEG，具有多(例如3或更多)條鏈，每條鏈都可直接或通過接頭連接到fflV融合抑制肽)；在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物可以是可生物降解的、和/或在體內(nèi)條件下隨時(shí)間裂解的支鏈多元醇。合適的多元醇包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多元醇包含PEG，所述PEG的平均分子量選自從約1000道爾頓到約20000道爾頓的范圍。本領(lǐng)域已知可使用的其它類型大分子栽體，所述栽體通常具有高于20000道爾頓的分子量。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"化學(xué)保護(hù)基團(tuán)"或"CPG"指用于阻斷含有胺基團(tuán)的反應(yīng)性官能團(tuán)與另一反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)部分。肽合成領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，化學(xué)保護(hù)基團(tuán)包括但不限于，tBu(叔丁基)、trt(三苯甲基(trityl))、OtBu(叔丁氧基)、Boc或t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-勞甲氧羰基)、Aoc(叔戊氧羰基)、TEOC(p-三甲基乙氧羰基)、CLIMOC(2-氯-l-茚滿基甲氧羰基)、BIMOC(苯-[f]-茚-3-甲氧羰基)、PBF(2，2,4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)、2-Cl-Z(氯千氧羰基)、Alloc(輝丙氧羰基)、Cbz(芐氧羰基)、Adoc(金剛烷氧羰基)、Mcb(甲基環(huán)丁氧羰基)、Bpoc(2-(對-聯(lián)苯基)丙基-2-氧羰基)、Azoc(2-(對-苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz(2,2二甲基-3，5-二甲氧千基-氧羰基)、MTf(4-甲氧基-2，3,6-三甲氧基苯基磺?；?、PMC(2，2，5,7，8-五甲基色滿-6-磺?；?、Tos(對甲苯磺酰基)、Hmb(2-羥基-4-甲氧千基)、Poc(2-苯丙基-2-氧羰基)、Dde(l-(4，4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己-l-亞基)乙基)、ivDde(l，(4，4-二甲基-2，6-二氧代國環(huán)己-l-亞基)-3-甲基丁基)、千基、丹磺?；?、對-硝基千酯等。一種化學(xué)保護(hù)基團(tuán)可用于排除另一種化學(xué)保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，本領(lǐng)域已知術(shù)語"去保護(hù)"指從含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)的分子上去除一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)的過程，其中所述分子包含氨基酸、肽片段、或HIV融合抑制肽。通常，去保護(hù)過程涉及被一個(gè)或多個(gè)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的分子與去除所述化學(xué)保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)試劑反應(yīng)。例如，被化學(xué)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的N-末端a氨基可與堿反應(yīng)以去除^威不穩(wěn)定的化學(xué)保護(hù)基團(tuán)(例如Fmoc等)?；瘜W(xué)保護(hù)基團(tuán)(例如Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)用酸去除。其它化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，尤其是衍生自羧酸的基團(tuán)，可用酸或堿去除。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"衍生物"指通過用另一個(gè)原子或另一組原子替換一個(gè)或多個(gè)原子從而由母體化合物產(chǎn)生的化合物，其中所述化合物為抗病毒化合物時(shí)，優(yōu)選地保留母體化合物的所有或基本所有抗病毒活性。術(shù)語"第一"、"第二"、"第三"等，在本文中可用于(a)表明順序；或(b)區(qū)分分子或分子的反應(yīng)性官能團(tuán)；或(c)，(a)和(b)的組合。但是術(shù)語"第一"、"第二"、"第三"等不應(yīng)另外理解為限制本發(fā)明。涉及本發(fā)明的HIV融合抑制肽時(shí)，術(shù)語"肽片段"和"中間體"在本文中同義使用，且當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，指包含長度不少于約5個(gè)氨基酸且不多于約30個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的肽，并且包含所述fflV融合抑制肽的氨基酸序列的至少一部分(連續(xù)的氨基酸)?？捎糜谥苽銼EQIDNO:9和10的肽片段的示例性例子參見本發(fā)明實(shí)施例4-7，以及表4、5、7和8。另外，當(dāng)在優(yōu)選的實(shí)施方案中合成肽片段(單獨(dú)地或組合成一組以形成fflV融合抑制肽)由此在氨基酸殘基之間形成肽鍵時(shí)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的反應(yīng)形成非肽鍵(例如亞胺基、酯、酰肼、偶氮、氨基脲等)。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"藥代動力學(xué)性質(zhì)"指隨著時(shí)間變化的系統(tǒng)性可利用的組合物中生物活性分子(例如抗病毒肽)的總量?？赏ㄟ^在體內(nèi)施用后測定所述生物活性分子(例如抗病毒肽)隨時(shí)間變化的全身總濃度來確定藥代動力學(xué)性質(zhì)。例如，藥代動力學(xué)性質(zhì)可用濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)、生物半衰期、和/或清除率表達(dá)。AUC是隨時(shí)間的全身生物活性分子濃度的積分度量，單位為質(zhì)量-時(shí)間/體積。施用一劑生物活性分子之后，自給藥時(shí)間點(diǎn)至體內(nèi)無活性成分存留的時(shí)間點(diǎn)的AUC是個(gè)體暴露于所述生物活性分子(和/或所述生物活性分子的代謝物)的度量。當(dāng)組合物所包含的生物活性分子與本發(fā)明所述制劑以外的制劑中包含的生物活性分子相比具有以下一種或多種特征時(shí)，所述組合物具有"改善的"或"提高的"藥代動力學(xué)性質(zhì)(a)更長的("提高的")生物(末端消除)半衰期("t1//)，(b)生物(全身)清除率(C1)的降低，(c)更長的持續(xù)釋放性質(zhì)，(d)在所述組合物中提高的重量百分比(例如約10%或更高)，(e)降低的或更低的C隨，(f)更長的t薩，和(g)更長的to.oi或to.i。在一個(gè)實(shí)施方案中，改善的藥代動力學(xué)意味著相對于被比制劑生物活性分子清除率降低，例如典型地降低約2倍到約10倍。在另一實(shí)施方案中，改善的藥代動力學(xué)意味著相對于被比制劑，生物半衰期延長約10%到約60%。改善的藥代動力學(xué)還可同時(shí)包括清除率降低和生物半衰期延長。在一個(gè)實(shí)施方案中，理想的藥代動力學(xué)性質(zhì)包括迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小時(shí)內(nèi))達(dá)到Cmax，然后在5、7、10、14、17、21或28天或更長時(shí)間保持相對恒定的血漿濃度。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物的理想藥代動力學(xué)性質(zhì)為更低的Cmax、更長的tma^和更長的to.(H或t(u。用于計(jì)算血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)、全身總清除率(C1)、和末端消除半衰期(tV2)的公式在本發(fā)明實(shí)施例1中詳述。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，作為本領(lǐng)域中用于表示其中溶解了一種或多種固體的水溶液的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語"溶液中"指在本發(fā)明詳細(xì)描述的和可注射藥物制劑領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的濃度和溫度實(shí)際應(yīng)用條件下，包含了溶解在其中的生物活性分子例如HIV融合抑制肽的水溶液。本領(lǐng)域已知多種方法用于區(qū)分溶液形態(tài)和懸浮液形態(tài)，例如檢查視覺澄清度(溶液透明而懸浮液混濁)、光穿透等。"溶解度"由存在于水性液體溶液中的生物活性分子例如mv融合抑制肽的量(例如重量百分比)確定，所述溶液沒有可見的沉淀，且含有所述生物活性分子的水性液體沒有發(fā)生膠凝。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"持續(xù)釋放"指在施用后，生物活性分子在特定的時(shí)間間隔中連續(xù)不斷地釋放。當(dāng)在本文中用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)，術(shù)語"有效量"指可達(dá)到特定方法的理想結(jié)果的生物活性分子的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子的有效量可以是足以(通過其自身和/或與多劑量方案結(jié)合)降低(例如相對于所述生物活性分子不存在時(shí))患者體內(nèi)fflV病毒載量的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子的有效量可以是足以抑制(例如相對于所述生物活性分子不存在時(shí))HIV對細(xì)胞的感染或抑制病毒進(jìn)入耙細(xì)胞的量。這些抑制可使用本領(lǐng)域已知的方法測定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子的有效量可以是足以改善fflv感染相關(guān)癥狀的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)確定生物分子的有效量。涉及fflV感染時(shí)，術(shù)語"治療"或"療法"、或其語法上等同的表達(dá)可互換使用，且當(dāng)用于說明書和權(quán)利要求書時(shí)指包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽的組合物可被用于影響與HIV感染相關(guān)的一種或多種過程，或影響用作確定此類治療或療法(例如"治療應(yīng)用")的療效指標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)或終點(diǎn)。例如，生物活性分子可用于抑制以下一種或多種過程HIV向靶細(xì)胞的傳遞；HIV與把細(xì)胞的融合("fflV融合")；病毒進(jìn)入(在感染過程中HIV或其遺傳物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞的過程)；以及合胞體形成(例如HIV感染細(xì)胞與靶細(xì)胞的融合)。對于評估fflV感染治療或療法中藥物的功效，病毒抑制(由本領(lǐng)域已知的用于測定體液或組織中病毒載量的方法確定)是常用的主要終點(diǎn)，血液循環(huán)中的CD4+細(xì)胞數(shù)量的增多是常用的次要終點(diǎn)；上述兩者都是抑制HIV向耙細(xì)胞傳遞的可測效果。因此，包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽的組合物可用于影響治療應(yīng)用，包括病毒抑制和/或循環(huán)CD4+細(xì)胞相對數(shù)量增多。組合物本發(fā)明提供了可用于向患者施用生物活性分子的組合物。具體地，本發(fā)明提供了包含溶劑、膠凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的組合物。不受理論的限制，本發(fā)明提供的實(shí)施方案至少部分基于意外的發(fā)現(xiàn)，即可在組合物中提高所包含的生物活性分子的重量百分比而在施用于患者后顯示出理想的持續(xù)釋放性質(zhì)。本發(fā)明所述的組合物可構(gòu)成原位形成的凝膠組合物，因?yàn)樗鼋M合物在施用于患者并發(fā)生溶劑-皮下液體交換后包含基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)施用于患者時(shí)，本發(fā)明提供的組合物產(chǎn)生的生物分子血漿濃度迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小時(shí)內(nèi))達(dá)到Cmax并在5、7、10、14、17、21或28天或更長時(shí)間中才是供所述生物分子的相對恒定的血漿濃度。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物的理想藥代動力學(xué)性質(zhì)為更低的Cmax、更長的tmax和更長的t0.01或t0J。本發(fā)明4是供的組合物可用于，例如，施用包含某些抗病毒肽的組合物，所述抗病毒肽被稱作T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和Tl144(SEQIDNO:9)、或者上述肽中兩個(gè)或多個(gè)的組合，以及T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和T1144(SEQIDNO:9)各肽的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含溶劑、通過溶劑-皮下液體交換形成基質(zhì)的膠凝材料、以及至少一種生物活性分子，例如抗病毒肽，例如T20(SEQIDNO:2)、T1249(SEQIDNO:57)、T897(SEQIDNO:58)、T2635(SEQIDNO:5)、T999(SEQIDNO:59)和T1144(SEQIDNO:9)或上述肽的衍生物。所述組合物可以，例如，在施用前作為溶液或懸浮液存在。所述溶液或懸浮液可以是水性的或包含有機(jī)溶劑。在暴露于患者皮下空間中的液體后，所述膠凝材料可形成可生物降解的或至少可生物侵蝕的基質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以以液體形式施用于有此需要的患者，例如，通過皮下注射。所產(chǎn)生的基質(zhì)可以，例如，作為所述生物活性分子的持續(xù)釋放基質(zhì)。本發(fā)明提供的組合物通常包含至少一種膠凝材料，所述膠凝材料的量(例如，約50-1000mg/g、100-900mg/g、150-900mg/g、200-900mg/g、250-900mg/g、500-900mg/g、750-900mg/g或750-1000mg/g)足以在施用于患者后形成基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定膠凝材料適當(dāng)含量(單位mg/g)的方法是從運(yùn)載體比率添加運(yùn)載體膠凝材料組成，再乘以10。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料為丙交酯或乙交酯聚合物。在具體實(shí)施方案中，所述膠凝材料為乙酸異丁酸蔗津唐酯(SAIB)、聚丙交酯(PLA，例如PLA3L、PLA3M、或PLA-PEG)或聚丙交西旨-乙交酯共聚物(PLG、PLGA例如PLGA1、PLGA-葡萄糖、或PLGA-PEG)。本發(fā)明才是供的組合物還可包含生物活性分子，例如抗病毒肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明^是供的組合物包含足夠濃度的生物活性分子，由此可從施用于患者后形成的基質(zhì)(例如以持續(xù)釋放的方式)釋放有效劑量的所述生物活性分子。本發(fā)明提供的組合物通?？砂⑹┯脻舛戎辽?%的生物活性分子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物包含的生物活性分子(例如抗病毒肽)的量等于組合物重量的約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%或更高。在具體實(shí)施方案中，在施用于患者后，本發(fā)明提供的組合物形成基質(zhì)，所述基質(zhì)提供了所述生物活性分子的初始突釋，然后在所述組合物施用后的至少5、7、10或14天中持續(xù)釋放所述生物活性分子。在某些實(shí)施方案中，施用所述組合物后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24小時(shí)內(nèi)Qnax至少或大約為1pg/ml、2|ig/ml、3(ig/ml、4|xg/ml、5|ig/ml、6(ig/ml、7|xg/ml、8)ig/ml、9嗎/ml、10(ig/ml、11|xg/ml、12(ig/ml、13|ig/ml、14^g/ml或15ng/ml或更高。在某些實(shí)施方案中，通過向患者施用本發(fā)明4是供的組合物所提供的生物活性分子的持續(xù)釋放是在施用所述組合物后至少5、7、10、14、21、25或28天或更長時(shí)間中大于或等于0.1pg/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、1.25fxg/ml、1.5jig/ml或2.0|_ig/ml或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，該組合物在施用于患者后形成基質(zhì)(例如原位)，并在施用的12小時(shí)內(nèi)提供至少10嗎/ml的生物活性分子(例如抗病毒肽)的Cmax,然后持續(xù)釋放，使得在至少7天中血漿水平至少為1(xg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的包含抗病毒肽的組合物進(jìn)一步包含至少一種額外成分，例如藥學(xué)可接受載體、大分子、或其組合。在另一實(shí)施方案中，所述組合物包含一種或多種額外的生物活性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可包含T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144肽或上述肽的衍生物。在另一實(shí)施方案中，此類組合物可包含或進(jìn)一步包含一種或多種其它抗病毒劑?？蓡为?dú)或作為組合治療方案的一部分用于組合物的其它抗病毒劑包括但不限于，DP107(T21)或任何其它抗病毒多肽，例如美國專利6,541,020Bl(通過引用將其全部內(nèi)容結(jié)合到本文中)中所述的抗病毒多肽。其它示例性的、非限制性的治療劑的例子包括抗病毒劑例如細(xì)胞因子，例如rIFNa、rIFNp、rIFNy;逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，包括但不限于，阿巴卡韋、AZT(齊多夫定)、ddC(扎西他賓)、奈韋拉平、ddl(地達(dá)諾新)、FTC(恩曲他濱)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韋定、依法韋侖、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韋、泰洛福韋、和阿洛夫定；蛋白酶抑制劑，包括但不限于，安普那韋(amprenivir)、CGP-73547、CGP國61755、DMP誦450、印地那韋、那非那韋、P而-l楊90、利托那韋、沙奎那韋、替利那韋、替拉那韋(tipranovir)、阿扎那韋、洛匹那韋、ABT378、ABT538和MK639;病毒mRNA加帽抑制劑，例如利巴韋林；作為具有抗HIV活性的脂質(zhì)結(jié)合分子的兩性霉素B;作為糖蛋白加工抑制劑的澳粟精胺(castanospermine);病毒進(jìn)入抑制劑，例如融合抑制劑(恩夫韋地、T1249、其它融合抑制肽，以及小分子)、SCH-D、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(TanoxInc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro140、Pro542(Progenies)、FP-21399(EMDLexigen)、BMS806、BMS-488043(Bristol-MyersSquibb)、馬拉維若(UK-427857)、ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167、和GSK-873、140(GlaxoSmithKline);CXCR4拮抗劑，例如AMD-070;脂質(zhì)和/或膽固醇相互作用調(diào)節(jié)劑，例如鹽酸普魯卡因(SP-01和SP-01A);整合酶抑制劑，包括但不限于，L-870和810;RNA酶H抑制劑；rev或REV抑制劑；vif抑制劑(例如源于vif的富含脯氨酸的肽、源于fflV-l蛋白酶N端的肽)；病毒加工抑制劑，包括但不限于，樺木醇和二氫樺木醇衍生物(例如PA-457);以及免疫調(diào)節(jié)劑，包括但不限于，AS-lOl、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸腺噴丁。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述生物活性分子(例如抗病毒肽)被溶解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述生物活性分子(例如抗病毒肽M皮懸浮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為噴霧干燥形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鹽(例如金屬鹽)的噴霧干燥形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明4是供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鋅的噴霧干燥形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明4是供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鈣的噴霧干燥形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鐵的噴霧干燥形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鹽(例如金屬鹽)的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鋅的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鈣的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鐵的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鎂的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含銅的沉淀形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其中所述懸浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)為包含鋁的沉淀形,式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含約為1-15%、1-14%、1陽13%、1國12%、1國11%、1-10%、1-9%、1-8%、1-7%、1國6%、l隱5%、1-4%、1-3%、1國2%、5-15%、7-15%、5-10%、7-10%或10-15%的鹽(例如金屬鹽)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明^是供了包含鹽(例如金屬鹽)的組合物，所述鹽與生物分子(例如抗病毒肽)以摩爾比1:1存在?？捎糜诒景l(fā)明提供的組合物的金屬鹽具體例子包括但不限于，鋅、鈣和鐵。通過改變本發(fā)明提供的組合物中膠凝材料的比率，可以調(diào)節(jié)(例如改善或優(yōu)化)生物分子自基質(zhì)的遞送率，所述基質(zhì)在向患者施用本發(fā)明提供的組合物后形成。在具體實(shí)施方案中，降低本發(fā)明提供的組合物中的SAIB:PLA比率可導(dǎo)致生物分子在患者體內(nèi)的血漿濃度在任何特定時(shí)間升高，并可延長生物分子的特定血漿水平在患者體內(nèi)保持的時(shí)間。在具體實(shí)施方案中，使用NMP代替三乙酸甘油酯或苯甲酸千酯作為本發(fā)明提供的組合物中的溶劑可導(dǎo)致生物分子在患者體內(nèi)的血漿濃度在任何特定時(shí)間升高，并可延長生物分子的特定血漿水平在患者體內(nèi)保持的時(shí)間。在具體實(shí)施方案中，使用NMP代替三乙酸甘油酯作為溶劑可導(dǎo)致C隨升高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加本發(fā)明4是供的組合物的施用注射體積(例如加倍)可導(dǎo)致生物分子在患者體內(nèi)的血漿濃度在任何特定時(shí)間升高，并可延長生物分子的特定血漿水平在患者體內(nèi)保持的時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的膠凝材料(例如PLA)的類型可影響本發(fā)明才是供的組合物的藥代動力學(xué)參數(shù)。在具體實(shí)施方案中，PLA類型從3L改變?yōu)?M可導(dǎo)致Cmax降低、tmax增加和t0.01增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變本發(fā)明提供的組合物中膠凝材料與溶劑的比率可影響生物分子的遞送率。在具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明提供的組合物中提高膠凝材料對溶劑的比率(例如PLGA1A對NMP)可導(dǎo)致C醒降低、tn^增力口和to.oi增力口。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變聚合物類型和分子量可改善生物分子的遞送率。在具體實(shí)施方案中，增加聚合物分子量和/或增加L:G(丙交酯乙交酯)比率可導(dǎo)致Cmax降低、tmax增加和to.oi增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提高本發(fā)明提供的組合物中的肽濃度(例如加倍)可導(dǎo)致Cmax降低、tm狀增加和to.(U減少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提高所述運(yùn)載體中的膠凝材料(例如PLGA)的量可導(dǎo)致Cmax降低、tmax增加和t0.01減少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述運(yùn)載體(例如包含SAIB的運(yùn)載體)中增加膠凝材料(例如PLA)的量可減緩生物分子從本發(fā)明提供的組合物中的釋放(例如降低Cmax、增加Uax和/或增加to川)。在具體實(shí)施方案中，將所述運(yùn)載體中的PLA量從10/0增加到5%可進(jìn)一步減緩生物分子從本發(fā)明提供的組合物中的釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述運(yùn)載體中的PLA量從5Q/o增加到10%可進(jìn)一步減緩生物分子從本發(fā)明提供的組合物中的釋放。溶劑可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的溶劑包括可充分稀釋膠凝材料以允許向患者注射所述組合物的任何可與水混溶的液體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑為N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。其它合適的溶劑包括但不限于，水、醇類(例如甲醇、乙醇、異丙醇和苯甲醇)、二醇類(例如聚乙二醇、丙二醇和四甘醇)、苯甲酸酯(例如苯甲酸乙酯和苯甲酸芐酯)、甘油酯(例如甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯)、三乙酸甘油酯和藥學(xué)可接受酯(例如乳酸乙酯和碳酸丙酯)。膠凝材料可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的膠凝材料包括可通過溶劑-皮下液體交換形成基質(zhì)的任何可與溶劑混溶的材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料為乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)或其衍生物，例如乙酸蔗糖酯或特級乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB-SG)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料為聚丙交酯(PLA)，例如PLA3L或PLA3M。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料為聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG、PLGA、PLGA-葡萄糖或其衍生物，例如PLGA-PEG1500或PLA-PEG1500)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料為聚己內(nèi)酯或其衍生物或其丙交酯/乙交酯共聚物。PLA和PLGA的區(qū)別在于丙交酯/乙交酯的比率、分子量和末端基團(tuán)。分子量以名稱中的數(shù)字分級。分子量估值為所述數(shù)字的10000倍。所述末端基團(tuán)是羧酸(A)、甲酯(M)或月桂醇酯(L)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物可包含以相同或不同重量百分比存在的兩種或多種不同的膠凝材料。在具體實(shí)施方案中，所述膠凝材料為兩種或多種選自PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖的材料的混合物。在某些實(shí)施方案中，所述膠凝材料存在的量為約5-95%重量、約5-90%重量、約10-90%重量、約10-85%重量、約15-85%重量、約20-85%重量、約30-85%重量、約30-80%重量、約30-70%重量、約30-65%重量、約30-60%重量、約40-85%重量、約45-85%重量、約50-85%重量、約55-85%重量、約60-85%重量、約65-85%重量、約70-85%重量、約75-85%重量、約80-85%重量、約1-15%重量、約5-15%重量或約10-15%重量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述膠凝材料存在的量為約25-900mg/g、100-900mg/g、200-900mg/g、300-900mg/g、400-900mg/g、500-900mg/g、100誦800mg/g、100國700mg/g、100誦600mg/g、100-500mg/g、200-800mg/g、300-600mg/g、25-250mg/g、25-200mg/g、25-150mg/g、50-150mg/g、50-100mg/g、50mg/g、75mg/g或100mg/g。肽對于抗病毒肽生物活性分子，本領(lǐng)域已知的任何抗病毒肽都可用于本發(fā)明4是供的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗病毒肽為T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144或上述肽的衍生物?？捎糜诒景l(fā)明提供的組合物和方法的特定抗病毒肽包括源自基本氨基酸序列("基本序列")的fflV融合抑制肽，所述基本序列具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，但是其中每種fflV融合抑制肽與基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于一個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序，并且在其氨基酸序列中除形成亮氨酸拉鏈樣基序所必需的亮氨酸以外具有至少一個(gè)額外的亮氨酸(即在所述序列中除亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位點(diǎn)1或8以外的氨基酸；例如在SEQIDNO:5的氨基酸位點(diǎn)21用亮氨酸替換異亮氨酸)。可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括源自基本氨基酸序列("基本序列")的mV融合抑制肽，所述基本序列具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，但是其中每種HIV融合抑制肽與基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于兩個(gè)的亮氨酸拉鏈樣基序。可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括一系列HIV融合抑制肽，其中每種HIV融合抑制肽(a)包含源自HIVgp41HR2區(qū)域的氨基酸序列；(b)具有不少于2個(gè)且不多于5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位點(diǎn)1或8以外具有至少一個(gè)額外的亮氨酸(例如，與SEQIDNO:5-7中任何一個(gè)或多個(gè)序列的基本序列比較)；并且任選地(d)在一種或多種生物學(xué)性質(zhì)方面顯示出意想不到的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽包含源自HIVgp41HR2區(qū)域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉鏈樣基序，例如圖1或圖2顯示的HR2亮氨酸拉鏈樣基序。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽長度為14到60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽進(jìn)一步包含N末端封閉基團(tuán)或C末端封閉基團(tuán)或上述兩者；所述末端封閉基團(tuán)可包括，但不限于位于N末端的氨基或乙跣基；以及位于C末端的羧基或酰胺基?？捎糜诒景l(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括HIV融合抑制肽，其中每種HIV融合抑制肽(a)包含源自fflVgp41HR2區(qū)域的氨基酸序列；(b)具有含有多于2個(gè)且不多于5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列；并且(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸位點(diǎn)1或8以外具有至少一個(gè)額外的亮氨酸(例如，與SEQIDNO:5-7中任何一個(gè)或多個(gè)序列的基本序列比較)；并且(d)在一種或多種生物學(xué)性質(zhì)方面顯示出意想不到的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV融合抑制肽包含源自fflVgp41HR2區(qū)域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉鏈樣基序，例如圖1或圖2顯示的HR2亮氨酸拉鏈樣基序。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HIV融合抑制肽長度為14到60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV融合抑制肽迸一步包含N末端封閉基團(tuán)或C末端封閉基團(tuán)或上述兩者；所述末端基團(tuán)可包括但不限于位于N末端的氨基或乙?；灰约拔挥贑末端的羧基或酰胺基。可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括具有與SEQIDNO:5相似氨基酸序列的fflV融合抑制肽，但是所述fflV融合抑制肽氨基酸序列(a)具有多于一個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，并且除了形成亮氨酸拉鏈樣基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨酸拉鏈樣基序的1或8位點(diǎn)以外)具有至少一個(gè)額外的亮氨酸；或(b)具有多于2個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序；并且其中所述fflV融合抑制肽在一種或多種生物學(xué)性質(zhì)方面顯示出改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽長度為14到60個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述fflV融合抑制肽包含源自fflVgp41HR2區(qū)域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉鏈樣基序，例如圖1或圖2顯示的HR2亮氨酸拉鏈樣基序?？捎糜诒景l(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQIDNO:9、10、14、和15所示的肽，或者與SEQIDNO:9、10、14、和15中任一序列相比包含l到3個(gè)氨基酸差異的fflV融合抑制肽。方法的其它抗病毒肽包括氨基酸序列與SEQIDNO:5基本氨基酸序列相似的HIV融合抑制肽，但是與所述基本氨基酸序列相比，所述fflV融合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于2個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序；其中所述HIV融合抑制肽在一種或多種生物學(xué)性質(zhì)方面顯示出意想不到的改善。可用于本發(fā)明提供的組合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQIDNO:ll-13所示的肽，或者與SEQIDNO:ll-13中任一序列相比包含l到3個(gè)氨基酸差異的HIV融合抑制肽。本發(fā)明所述的fflV融合抑制肽可通過熟知的方法常規(guī)制備，所述方法包括編碼所述肽的核酸的重組表達(dá)。例如，用于重組表達(dá)HIV融合抑制肽的工程細(xì)胞可在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間以表達(dá)所述肽，并且所述肽可由此獲得。本發(fā)明所述的fflV融合抑制肽也可通過合成方法制備。以下是可用于本發(fā)明所述的組合物的具體肽片段。每個(gè)肽片段都可以作為中間體，該中間體可與一組肽片段中的一個(gè)或多個(gè)其它肽片段共價(jià)結(jié)合從而產(chǎn)生具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15的氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一組肽片段中，肽片段在液相過程中以一定方式結(jié)合從而產(chǎn)生所需的具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15的氨基酸序列的HIV融合抑制肽。通過如下方式制備的fflV融合抑制肽也可用于本發(fā)明才是供的組合物合成所述fflV融合抑制肽的組成肽片段，然后將所述肽片段組裝成所述fflV融合抑制肽，其中所述fflV融合抑制肽具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備肽的方法，所述方法包含將所述肽噴霧干燥。例如，肽可在pH小于4或大于6時(shí)溶解(例如在水中)，其中使用合適的酸或堿例如1NNaOH或1NHC1調(diào)節(jié)pH，然后將所述肽溶液通過噴霧嘴噴到加熱的箱體中。可人工收集干燥的肽顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述噴霧干燥方法進(jìn)一步包含向所述噴霧干燥溶液加入賦形劑，由此摻入賦形劑與肽。示例性賦形劑的實(shí)例包括但不限于，填充劑、膨脹劑、稀釋劑、濕潤劑、溶劑、乳化劑、防腐劑、調(diào)味劑、吸收促進(jìn)劑、持續(xù)釋放基質(zhì)、著色劑、和大分子物質(zhì)例如白蛋白、或例如氨基酸和糖的物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備肽的方法，所述方法包括將肽溶液通過噴霧嘴噴到(與噴霧干燥方式相似)另一溶液(例如金屬鹽溶液，例如鋅鹽、鐵鹽或鈣鹽溶液)中?？蓪⑺脩腋∫弘x心，棄去上清液，冷凍沉淀。所述沉淀可凍干并過200pm篩。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備肽的方法，所述方法包含鹽沉淀或pH沉淀，其中肽可在pH小于4或大于6時(shí)溶解(例如在水中)，其中使用合適的酸或堿例如1NNaOH或INHC1調(diào)節(jié)pH至約4到6之間或約4.8到5.2之間。在具體實(shí)施方案中，所述方法包含向肽溶液中加入鹽溶液或強(qiáng)酸/堿溶液以導(dǎo)致沉淀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含通過離心收集沉淀、通過凍干干燥沉淀、以及任選地將沉淀過200nm篩以控制顆粒大小。不受理論限制，認(rèn)為用于制備本發(fā)明提供的組合物的肽的方法和試劑可產(chǎn)生有益于某些患者或疾病的理想的或改善的藥代動力學(xué)參數(shù)(例如釋放生物活性分子的量或持續(xù)時(shí)間)。尤其是，金屬(例如鋅、鐵或改)結(jié)合到肽沉淀中鋅含量)可降低Cm狀、增加U狀并增加t0.01。在另一實(shí)施方案中，向低金屬(例如低鋅)沉淀加入作為凍干鹽的金屬鹽(例如疏酸鋅)可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。在另一實(shí)施方案中，沉淀出肽的溶液可影響Cm狀和tmax。例如，從50:50甲醇:水中沉淀出肽相對于從純水中沉淀出肽可降低Cmax并增加tmaxo在另一實(shí)施方案中，制備肽的方式可影響c隨和t隨大。例如，噴霧沉淀相對于非噴霧沉淀可升高Cmax并增加tmax。使用方法本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用本發(fā)明提供的組合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物用作治療方案例如抗病毒治療方案的一部分。在某些實(shí)施方案中，這樣的治療方案可以，例如，被用于治療fflv感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明提供的組合物抑制HIV向耙細(xì)胞傳遞的方法，所述方法包括向患者施用一定量的本發(fā)明提供的組合物，以使所述靶細(xì)胞與抑制細(xì)胞被病毒感染的有效量的活性藥劑(例如抗病毒肽)接觸。所述方法可以，例如用于治療HIV感染患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制HIV向耙細(xì)胞傳遞包括抑制gp41介導(dǎo)的HIV-1與耙細(xì)胞融合和/或抑制HIV感染細(xì)胞與耙細(xì)胞合胞體形成。本發(fā)明還提供了治療fflV感染(在一個(gè)實(shí)施方案中，fflV-1感染)的方法，所述方法包括向HIV感染患者以治療fflV感染的有效量施用本發(fā)明提供的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含抑制HIV向把細(xì)胞傳遞的有效量的fflV融合抑制肽，和/或抑制gp41介導(dǎo)的HIV與粑細(xì)胞融合的有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可以，例如，用于治療fflV感染患者。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改善fflV感染相關(guān)癥狀的方法，所迷方法包括向fflV感染患者施用包含溶劑、膠凝材料和肽的組合物，其中所迷肽選自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述狀的組合。fflV感染的藥物(例如用于抑制HIV傳遞的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治療HIV感染的方法)的方法。所述藥物可為藥物組合物形式，所述藥物組合物包含生物活性分子例如fflV融合抑制肽、溶劑、膠凝材料，并任選地包含一種或多種藥學(xué)可接受載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物可通過注射施用，例如皮下注射。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物可每3、5、7、10、14、17、21、28或60天施用(例如通過皮下注射)一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明4是供的組合物可持續(xù)一天或多天、一周或多周、一月或多月、或一年或多年每天施用(例如通過皮下注射)l次、2次、3次或更多次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物可每周施用(例如通過皮下注射)l次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物可每周施用(例如通過皮下注射)l次或2次。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物每2周施用(例如通過皮下注射)2次。每次施用可包含l次、2次、3次或更多次注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的組合物的施用體積為10(Hd、200^1、300^1、400pl、500^1、600|il、700^1、800^1、900W、1000pl或更多。在以下實(shí)施例中，評估了多種生物物理學(xué)參數(shù)和生物學(xué)參數(shù)。確定所述參數(shù)的方法如下所述。使用標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)并使用標(biāo)準(zhǔn)FMOC肽化學(xué)法，或如本發(fā)明實(shí)施例3詳述的固相合成與液相合成的組合在肽合成4義上合成肽，包括HIV融合抑制肽和基本序列。在本實(shí)施例中，所述fflV融合抑制肽可進(jìn)一步包含反應(yīng)性官能團(tuán)，即大部分所述反應(yīng)性官能團(tuán)在N端被乙酰基保護(hù)和/或在C端被酰胺基保護(hù)。從樹脂上脫離后，所述肽被沉淀，所述沉淀被凍干。然后使用反相高效液相色譜純化所述肽；用電噴霧質(zhì)譜法確認(rèn)肽的身份。生物物理參數(shù)的評估包括測定螺旋度和熱穩(wěn)定性。使用圓二色譜("CD")如下測定螺旋度。簡單地說，使用配有熱電溫控器的分光計(jì)獲得CD光譜。光譜獲得條件為25°C，從200到260nm步進(jìn)0.5納米(nm)，帶寬L5nm，典型平均時(shí)間4秒/步?？鄢?xì)胞/緩沖液空白后，使用保守窗口大小通過三階最小二乘多項(xiàng)式擬合平滑光譜以給出隨機(jī)殘差。原始橢圓率數(shù)值使用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)換為平均殘基橢圓率，并用波長(200到260nm)對[e]X10、度cm々dmol)作圖。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算百分比螺旋度值(通常表示為10nM、25。C的百分比螺旋度)。熱穩(wěn)定性評估如下進(jìn)行當(dāng)以2°C步進(jìn)升高溫度時(shí)監(jiān)測CD信號在222nm處的變化，平衡時(shí)間為l分鐘。每個(gè)樣品(例如fflV融合抑制肽)的熱穩(wěn)定性(以Tm值表示)是對應(yīng)于熱轉(zhuǎn)變一階導(dǎo)數(shù)最大值的溫度。生物學(xué)性質(zhì)的評估包括測定對HIV-1毒抹的抗病毒活性。在確定fflV融合抑制肽抗病毒活性(例如，一種測量是抑制fflV向耙細(xì)胞傳遞的能力)時(shí)，使用了體外分析，通過使用源于HIVgp41HR區(qū)域的肽產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，所述體外分析已經(jīng)顯示對體內(nèi)觀察到的抗病毒活性具有預(yù)測性。更具體地，對于相同的源于HIVgp41的肽，使用體外感染性分析("Magi-CCR5感染性分析"，參見例如美國專利號6，258,782)觀察到的抗病毒活性已顯示出與體內(nèi)抗病毒活性合理相關(guān)(參見，例如Kilby等人，1998,NatureMed.4:1302-1307)。所述分析使用指示細(xì)胞系MAGI或表達(dá)衍生cMAGI的CCR5對感染性病毒滴度降低迸行記分。上述兩種細(xì)胞系都利用fflV-ltat的能力以反式激活HIV-LTR驅(qū)動的P-半乳糖苷酶(P-gal)報(bào)告基因的表達(dá)。所迷p-gal報(bào)告基因已被修飾以定位在細(xì)胞核內(nèi)，并可在感染后幾天內(nèi)用X-gal底物強(qiáng)烈核染色檢測。如果染色前只有一輪感染，被染色的核數(shù)量就可解釋為等于激發(fā)接種物(challengeinoculum)中的感染性病毒粒子數(shù)量。感染的細(xì)胞用CCD-成像器計(jì)數(shù)，原代細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)室改變的分離抹都顯示出病毒輸入和成像器顯示的感染細(xì)胞數(shù)量之間的線性關(guān)系。在MAGI和cMAGI分析中，感染性滴度降低50%(Vn/Vo=0.5)是顯著的，并提供了評估抗病毒活性的主要截?cái)嘀?"IC50"定義為導(dǎo)致感染性病毒滴度降低50%的活性成分濃度)。用于測試抗病毒活性的肽被稀釋成多種濃度，并針對HIV接種進(jìn)行2次或3次重復(fù)測試，所述fflV接種物經(jīng)調(diào)整在48孔微量滴定板中產(chǎn)生約1500到2000個(gè)感染細(xì)胞/孔。所述肽(在相應(yīng)稀釋中)被加入cMAGI或MAGI細(xì)胞中，然后是病毒接種物；24小時(shí)后，加入感染和細(xì)胞-細(xì)胞融合抑制劑(例如SEQIDNO:2(恩夫韋地))以防止第二輪fflV感染和細(xì)胞-細(xì)胞病毒傳播。所述細(xì)胞再培養(yǎng)2天，然后固定并用X-gal底物染色以檢測fflV感染細(xì)胞。每個(gè)對照和肽稀釋物的感染細(xì)胞數(shù)量用CCD成像器確定，然后計(jì)算IC50(以^g/ml表示)。對由基本序列組成的肽的抗病毒活性具有抗性的病毒可使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法制備?；径?，在計(jì)算IC50和IC90后，細(xì)胞與病毒和肽(例如濃度接近IC90)在培養(yǎng)物中混合(包括當(dāng)所述細(xì)胞此后分瓶時(shí))。維持并監(jiān)測所述培養(yǎng)物直至合胞體出現(xiàn)。從第一輪培養(yǎng)收獲的病毒用于在第二輪培養(yǎng)中感染細(xì)胞，肽的濃度高于(2到4倍)第一輪培養(yǎng)使用的濃度。維持并監(jiān)測第二輪培養(yǎng)物中對所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒的存在?？赡苄枰S后幾輪培養(yǎng)以最終產(chǎn)生對所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒分離抹(在抗此類分離抹的肽的IC50預(yù)定水平)。為確定藥代動力學(xué)性質(zhì)，將HIV融合抑制肽或衍生出fflV融合抑制肽的基本序列靜脈內(nèi)施用到獼猴(Macacafasicularis)(如本領(lǐng)域已知，其它動物模型也可用于確定藥代動力學(xué)性質(zhì))。在施用后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取血樣并離心分離血漿。冷凍保存血漿樣品直至在電噴霧陽離子模式下進(jìn)行LC-MS(液相色譜/質(zhì)譜)分析。使用pH6.8的10mM乙酸銨緩沖液中的乙腈梯度將HIV融合抑制劑或基本序列從C18或C8HPLC柱上洗脫。分析時(shí)，使用2倍或3倍體積的包含0.5%甲酸的乙腈將血漿樣品去蛋白。獼猴血漿樣品的雙份校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)與所述樣品同時(shí)制備，并在所述包含HIV融合抑制肽或基本序列的樣品之前或之后分析。使用單指數(shù)或雙指數(shù)數(shù)學(xué)模型從血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)計(jì)算出藥代動力學(xué)性質(zhì)。通過非線性最小二乘優(yōu)化獲得模型。使用了濃度1(2權(quán)重。使用以下方程計(jì)算血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)、全身清除率(C1)、和末端消除半衰期(t1/2)。AUC=A/國a+B/-b其中A和B為截距，a和b為指數(shù)方程的速率常數(shù)，分別描述分布期和消除期。當(dāng)使用單指數(shù)模型時(shí)，消除參數(shù)"A"和"a"。Cl=劑量/AUC(以L/K/hr表示)t72二-0.6903/b(以小時(shí)(hr)表示)實(shí)施例2為說明本發(fā)明4是供的實(shí)施方案，基本序列具有如下氨基酸序列(SEQIDNO:5)。TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL在二個(gè)實(shí)施方案中，HIV融合抑制肽與其來源的基本序列相比，包含多于2個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序。這些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于，SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、和SEQIDNO:13;或與SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、或SEQIDNO:13中任一序列相比具有1到3個(gè)氨基酸差異(例如，至少92%—致性)的氨基酸序列；每個(gè)fflV融合抑制肽具有3到5個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的氨基酸序列。以下圖示(I)顯示了HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位點(diǎn)下方(用"廣對齊)用單字母氨基酸編碼("L"表示亮氨酸，T，表示異亮氨酸)表示氨基酸差異(與基本序列相比)，且參與亮氨酸拉鏈樣基序的異亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉鏈樣基序的1或8位點(diǎn)，或一個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的8位點(diǎn)和相鄰亮氨酸拉鏈樣基序的1位點(diǎn))用下劃線標(biāo)示。一個(gè)亮氨酸拉鏈的1或8位點(diǎn)也可作為序列中另一亮氨酸拉鏈樣基序的相對末端位點(diǎn)，即作為一個(gè)基序的8位點(diǎn)和另一相鄰基序的1位點(diǎn)。0)TTWEAWDRAJAEYAARIEAIJRMQEQQEKNEAALRELSEQIDNO:5LLSEQIDNO:"!LSEQ師0:12L!SECHDNO:13在另一個(gè)實(shí)施方案中，HIV融合抑制肽與其來源的基本序列相比，包含多于1個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，以及不參與形成亮氨酸拉鏈樣基序的額外的亮氨酸。這些fflV融合抑制肽的例子包括但不限于，SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:14、和SEQIDNO:15;或與SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15中任一序列相比具有1到3個(gè)氨基酸差異(例如，至少92%—致性)的氨基酸序列；并且每種fflV融合抑制肽氨基酸序列與SEQIDNO:5基本序列的不同點(diǎn)在于包含多于1個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序，以及不參與形成亮氨酸拉鏈樣基序的額外的亮氨酸(即，除亮氨酸拉鏈樣基序1或8位點(diǎn)以外的亮氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，非亮氨酸拉鏈樣基序亮氨酸替換在SEQIDNO:5基本序列的氨基酸位點(diǎn)21替換了異亮氨酸，該替換提供了促進(jìn)所述肽的有利生物學(xué)性質(zhì)的因素。以下圖示(II)顯示了fflV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位點(diǎn)下方(用"廣對齊)用單字母氨基酸編碼("L"表示亮氨酸，"I"表示異亮氨酸)表示氨基酸差異(與基本序列相比)，且參與亮氨酸拉鏈樣基序的異亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉鏈樣基序的1或8位點(diǎn)，或一個(gè)亮氨酸拉鏈樣基序的8位點(diǎn)和相鄰亮氨酸拉鏈樣基序的l位點(diǎn))用下劃線標(biāo)示。不參與形成亮氨酸拉鏈樣基序的亮氨酸為斜體。仰TTWEAWDRAlAEYMFtiEALIRAAQEQQEKNEMLRELSEQIDNO:5乙LSEQIDNO:9LLSEQIDNO:10I—SEQIDNO:14￡_'1SECHDNO:15以下圖示(III)顯示了"基本序列"SEQIDNO:5與本發(fā)明公開的SEQIDNO:9-15肽的比較總結(jié)，SEQIDNO:9-15肽相對于SEQIDNO:5顯示出改善的生物學(xué)性質(zhì)。SEQIDNO:9-15中各序列相對于SEQIDNO:5基本序列的氨基酸替換用下劃線和粗體標(biāo)示。(III)SEQTON0:5TTWEAWDRAIAEYAARIEAURAAQEQOEKNEAALRELSEQ!DNO:9TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRAtQEQQEKNEAALRELSEQIDNO:10TTWEAWDRAIAEYAARIEALtRAAQEQQEK^EAALRELSEQIDNO:"TTWEAWDRAIAEYAARIEAURAfcQEOQEKLEAALRELSEQIDNO:12TTWEAWDRAIAEYAARIEAURAIQEQQEKtEAALRELTTWEAWDRAIAEYAARIEAURAiQEQQEJqEAALRELSEQIDNO:"TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRA，QEQQEKNEAALRELSEOIDNO:15TTWEAWDRAIAEYAARIEALtRAAQEQQEK!EAALREL參考表l，將根據(jù)本發(fā)明的HIV融合抑制肽與合成肽比較，所述合成肽具有相同的基本序列，但氨基酸序列有所不同(與SEQIDNO:9-15比較)，并具有抗fflV活性。所述比較包括用本發(fā)明實(shí)施例1所述的方法確定的生物物理參數(shù)和生物活性參數(shù)。在確定生物活性時(shí)，由于通過抗病毒活性進(jìn)行評估，使用了病毒分離林，所述病毒分離抹對已知抑制HIV介導(dǎo)的融合的某些肽的抗病毒活性具有抗性(所述抗性病毒分離抹在表1中命名為"Res")。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>SEQIDNO:6和SEQIDNO:7與基本序列SEQIDNO:5的不同在于單個(gè)亮氨酸替換(分別位于24位點(diǎn)和31位點(diǎn))；如以上表l所示，所述替換沒有顯著地影響抗病毒活性，但導(dǎo)致了半衰期的改善(參見以下表2)。SEQIDNO:6與根據(jù)本發(fā)明具有SEQIDNO:9的HIV融合抑制肽相似，但是SEQIDNO:9的氨基酸序列具有另一個(gè)氨基酸差異，氨基酸位點(diǎn)21的亮氨酸(而SEQIDNO:6在氨基酸位點(diǎn)21是異亮氨酸)。參考表l，與SEQIDNO:6的肽比較，SEQIDNO:9中亮氨酸替換異亮氨酸導(dǎo)致螺旋度降低(從97%到61%)，同時(shí)保持良好的抗性性質(zhì)(對抗性病毒分離抹"Res"的活性)。類似地，SEQIDNO:7的氨基酸序列與根據(jù)本發(fā)明具有SEQIDNO:IO的HIV融合抑制肽相似，但是SEQIDNO:10的氨基酸序列具有一個(gè)氨基酸差異，氨基酸位點(diǎn)21的亮氨酸(而SEQIDNO:7在氨基酸位點(diǎn)21是異亮氨酸)。參考表1，與SEQIDNO:7的肽比較，SEQIDNO:IO中亮氨酸替換異亮氨脧導(dǎo)致螺旋度降低(從84%到77%)，同時(shí)保持良好的抗性性質(zhì)(對抗性病毒分離抹"Res"的活性)。因此，表1顯示了SEQIDNO:9和10相對于SEQIDNO:6-7的改善性質(zhì)。本實(shí)施方案說明了與基本氨基酸序列相比，根據(jù)本發(fā)明的HIV融合抑制肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)。使用實(shí)施例1此前詳述的評估藥代動力學(xué)性質(zhì)的方法，表2說明了與基本序列SEQIDNO:5的藥代動力學(xué)性質(zhì)相比，根據(jù)本發(fā)明的HIV融合抑制肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)。SEQ,DNO:清除率ftikg/W半襲期(t論hr)>0.046多<0.0215177一/\AO《Q,吸12100.0221如表2所示，SEQIDNO:6、7、9和10都顯示出延長的生物半衰期("t1//)。SEQIDNO:8在氨基酸位點(diǎn)21而非氨基酸位點(diǎn)24或31為亮氨酸，沒有顯示出SEQIDNO:6、7、9和10肽所顯示的顯著延長的半衰期。為了在生產(chǎn)藥物制劑時(shí)將fflV融合抑制肽配制到藥學(xué)可接受載體中，在水溶液中的穩(wěn)定性可能是重要的參數(shù)，尤其是當(dāng)藥物制劑被腸胃外施用時(shí)。應(yīng)注意到，根據(jù)本發(fā)明的HIV融合抑制肽在生理pH下顯示出在水溶液中改善的穩(wěn)定性。例如，如下分別測試具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:5氨基酸序列的合成肽，和具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽的溶解度向磷酸緩沖液(PBS)中加入濃度為10mg/ml的所述肽，在1周(168小時(shí))時(shí)間中的不同時(shí)間點(diǎn)，測定(例如用HPLC)在37°C下約pH7.3到約pH7.5范圍內(nèi)的溶液中殘留的肽的量。包含SEQIDNO:2的溶液在僅僅數(shù)小時(shí)后變得不穩(wěn)定(溶液中檢測到最少量的肽)。相反，在1周的時(shí)間點(diǎn)仍可在溶液中檢測到90%或更多的fflV融合抑制肽具有SEQIDNO:9氨基酸序列，但是在1周的時(shí)間點(diǎn)只可在溶液中檢測到少于80%的肽具有SEQIDNO:5氨基酸序列。實(shí)施例3將本發(fā)明提供的HIV融合抑制肽的生物學(xué)性質(zhì)與其它公認(rèn)的有效抗病毒藥劑(包括SEQIDNO:2(恩夫韋地))進(jìn)行了比較。尤其是，將感興趣的新化合物SEQIDNO:9與公認(rèn)的抗病毒劑SEQIDNO:2進(jìn)行了體外抗性比較研究，詳述如下MT2細(xì)胞用病毒分離抹(IIIB、030、060和098)感染，并在濃度逐漸升高的SEQIDNO:2(恩夫韋地)或SEQIDNO:9中培養(yǎng)以選擇抗性。初始肽濃度約為各個(gè)肽對相應(yīng)野生型分離抹的ICso的2倍。通過每1-3天添加新鮮肽保持肽濃度。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測培養(yǎng)物的細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)，當(dāng)達(dá)到最大CPE時(shí)，將一小等份病毒用于隨后輪次的感染。與野生型病毒生長速率比較，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間，肽濃度升高2到4倍。在選擇期間，也收集不含肽的病毒儲液。不含肽的病毒儲液用雙脫氧測序化學(xué)法鑒定gp41的基因型改變，并使用cMAGI感染性分析確定表型易感性。使用SEQIDNO:2和SEQIDNO:9進(jìn)行體外選擇的比較結(jié)果如表3所示。這些數(shù)據(jù)顯示SEQIDN0:9選擇的培養(yǎng)時(shí)間比SEQIDNO:2選擇平均長3倍，導(dǎo)致ICsoSEQIDNO:9選擇需-更多以達(dá)到所述更低的倍數(shù)改變。更長的培養(yǎng)時(shí)間、更低的倍數(shù)改變、以及實(shí)現(xiàn)所述更低的倍數(shù)改變所需的更高的突變數(shù)量，都表明與SEQIDNO:2相比，SEQIDNO:9顯示出更不易發(fā)展體外抗性。也就是說，所述結(jié)果說明HIV出現(xiàn)對SEQIDNO:9的抗性比出現(xiàn)對SEQIDNO:2的抗性需要更長的時(shí)間?；谝郧皩ζ渌睦鏢EQIDNO:2和T1249的fflV抗性發(fā)展研究，人們可預(yù)期本發(fā)明提供的體外結(jié)果可與體內(nèi)結(jié)果合理地關(guān)聯(lián)。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>所要制備的HIV融合抑制肽完整氨基酸序列的相應(yīng)部分。在片段合成中，如果需要，加入的氨基酸可具有被化學(xué)保護(hù)劑化學(xué)保護(hù)的游離胺(例如側(cè)鏈胺)。然后組裝(以一定方式和順序共價(jià)結(jié)合)所述片段，由此制備(以正確的氨基酸序列)所述mv融合抑制肽。關(guān)于肽合成，可使用肽序列合成領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備各個(gè)肽片段自身，以及由一組肽片段組合生產(chǎn)的本發(fā)明提供的ffl—v融合抑制肽。例如，在一種方法中，肽片段可在固相中合成，然后在組裝過程中在液相中組合以制備產(chǎn)物fflV融合抑制肽。在另一種方法中，可使用液相合成制備肽片段，種方法中，各種肽片段可使用固相合成，然后在組裝過程中在固相中組合以制備fflV融合抑制肽的完整氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固相合成法制備各個(gè)肽片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用一組肽片段并使用固相和液相技術(shù)組合的組裝過程制備具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。例如，一組肽片段包含2到4個(gè)肽片段，所述片段被合成，然后組裝，以完成本發(fā)明提供的HIV融合抑制肽的合成?；诒景l(fā)明的教導(dǎo)，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，所述的片段組裝方法可用于、且已經(jīng)被用于具有SEQIDNO:9-16中任一序列的氨基酸序列的一些fflV融合抑制肽。為說明通過片段縮合法制備本發(fā)明提供的HIV融合抑制肽，在合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽的方法中，一組肽片段中的肽片段在肽片段組裝過程中共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明提供的肽片段可包括但不限于，具有如下表4所示氨基酸序列的肽片段。本發(fā)明提供的某些肽片段可用于排除其它肽片段。還標(biāo)示了各種肽片段在SEQIDNO:9中的對應(yīng)氨基酸；因此，顯示出各種肽片段由SEQIDNO:9氨基酸序列中多個(gè)連續(xù)的氨基酸組成(表4狄,列在SECUDNO:9中的#^酸位點(diǎn)17nWEAV^AIAE1-12匠27"3727-38ki1TTWEAWPRAI1-1037幼40"-3B1-26本發(fā)明還提供了特定的肽片段組，所述肽片段組在合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作為中間體。本發(fā)明提供的肽片段組包括1-16組，如表5所示(組的編號僅為描述方便)。某些肽片段組可用于排除其它肽片段組。匾o該i認(rèn)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>t一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可用于合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段組。從本發(fā)明描述中還顯而易見的是，所述方法、肽片段、和肽片段組可用于合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽，其中所述fflV融合抑制肽包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>其中一個(gè)或多個(gè)氨基末端、羧基末端、或側(cè)鏈游離反應(yīng)性官能團(tuán)(例如內(nèi)部賴氨酸的e胺)用化學(xué)基團(tuán)(B、U、Z;其中B、U、Z可為相同的化學(xué)基團(tuán)或不同的化學(xué)基團(tuán))修飾，所述化學(xué)基團(tuán)可包括但不限于，一種或多種以下基團(tuán)反應(yīng)性官能團(tuán)、化學(xué)保護(hù)基團(tuán)(CPG)、和接頭。本領(lǐng)域還已知可用于在肽片段N端、或肽片段C端、在內(nèi)部氨基酸的游離胺、或其組合處引入化學(xué)基團(tuán)的技術(shù)。與制備具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽有關(guān)，被保護(hù)的肽片段(具有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)的肽片段)的示例性實(shí)例包括但不限于，表6中所列的肽片段。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>Ac-乙?；?，NH2-氨基(但可為其它化學(xué)基團(tuán)，如本發(fā)明"定義"部分詳述)；CPG為化學(xué)保護(hù)基團(tuán)(例如，F(xiàn)moc或其它N端化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，如本文"定義"部分詳述)；U如上定義。實(shí)施例5參考表5(組1和組2)和圖3,說明了使用3種特定肽片段(例如SEQIDNO:17-19+Leu;或SEQIDNO:17、18、和20)并使用片段縮合法合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽的方法，所述片段縮合法包括將3個(gè)肽片段組合以制備fflV融合抑制肽。每個(gè)所述肽片段顯示出的物理性質(zhì)和溶解度特性使所述肽片段成為優(yōu)選肽片段(相對于二片段法)，以用于以高產(chǎn)量和高純度合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，且進(jìn)一步只需一種加樣樹脂作為起始材料(簡化合成方法)。通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成法200880018701.0圖3,"AA(1-12)")的肽片段(使用超酸敏感樹脂，例如4-羥甲基-3-甲氧苯氧基丁酸樹脂、或2-氯三苯甲基氯樹脂-"CTC"，圖3)，所述片段N端乙?；?"Ac"，作為化學(xué)基團(tuán))，C端具有羥基(-OH)(參見圖3，"Ac-AA(l-12)-OH")。通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成具有SEQIDNO:18氨基酸序列并包含SEQIDNO:9中第13-26位氨基酸(參見圖3，"AA(13-26)")的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán))，C端具有-OH(參見圖3，"Fmoc-AA(13-26)-OH")。通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成具有SEQIDNO:19氨基酸序列并包含SEQIDNO:9中第27-37位氨基酸(參見圖3，"Fmoc-AA(27-37)-OH")的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán))，C端具有-OH(參見圖3,"Fmoc-AA(27-37)-OH")。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的裂解劑、溶劑、和技術(shù)將各個(gè)肽片段從固相合成樹脂上裂解。然后如下分離各個(gè)肽片段通過蒸餾去除上述溶劑的大部分，并通過加水(加或不加含醇的助溶劑)沉淀所述肽片段。所得固體通過過濾分離、洗滌、在水或乙醇/水中重新制漿、再過濾、并在真空爐中干燥。如圖3所示，通過液相合成制備肽片段，其中具有SEQIDNO:19氨基酸序列的肽片段(參見圖3，"FmocAA(27-37)-OH")與SEQIDNO:9第38位氨基酸亮氨酸(已在液相中被酰胺化)化學(xué)結(jié)合，從而生成具有SEQIDNO:20氨基酸序列的肽片段(包含SEQIDNO:9中第27-38位氨基酸)，所述肽片段C端酰胺化(作為化學(xué)基團(tuán))(參見圖3，"Fmoc-AA(27-38)-NH2")。在一種合成方法用酰胺樹脂直接合成?？偨Y(jié)所述液相反應(yīng)，分離的肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH的羧基端被轉(zhuǎn)換成活性酯HOBT(l-羥基苯并三唑水合物)、6-C1HOBT、或HOAT(l-羥基-7-偶氮苯并三唑)，在DIEA(二異丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如，偶聯(lián)劑和消旋抑制劑的組合)存在下，所述轉(zhuǎn)換分別使用HBTU(O-苯并三氮唑l誦基-N，N，N'，N'陽四甲基脲六氟磷酸酯)或TBTU(O,笨并三氮唑-l-基-N，N,N'，N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、以及HOBT、6-C1HOBT、或HOAT。所述反應(yīng)在0到30°C在極性非質(zhì)子溶劑例如DMF(二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)中進(jìn)行。所述偶聯(lián)反應(yīng)完成時(shí)，將哌啶、石炭酸鉀、DBU或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它堿加入到所述反應(yīng)中(加或不加另外的助溶劑)以有效去除末端Fmoc保護(hù)基團(tuán)。所述反應(yīng)完成時(shí)，加入醇或可與水混溶的溶劑和/或水以沉淀肽片段，所述肽片段具有SEQIDNO:20氨基酸序列，并在C端酰胺化(H-AA(27-38)-NH2)。如圖3圖解說明，為在液相過程中使用肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH與亮氨酰胺(參見圖3，"H-Leu-NH2")組合制備肽片段H-AA(27-38)-NH2，將所述肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH(571g,205mmol,1當(dāng)量)、H-Leu-NH2(32.0g,246mmol,1.2當(dāng)量)、和6-C1HOBT(41.7g，246mmol,1.2當(dāng)量)加入到DMF(4568ml，8體積)中，用DIEA(53.6ml,307.5mmol，1.5當(dāng)量)處理并在室溫?cái)嚢柚敝寥芙?約20分鐘)。將所述溶液冷卻，并加入TBTU(79.0g，246mmol，1.2當(dāng)量)。將所述反應(yīng)在0t:攪拌，然后在25。C攪拌。當(dāng)HPLC分析顯示所述反應(yīng)完成時(shí)，加入p泉啶(81ml,820mmol,4當(dāng)量)以去除所述肽片段Fmoc-AA(27-38)-NH2的Fmoc保護(hù)基團(tuán)(也可使用其它堿，例如》友酸鉀、DBU等)。將反應(yīng)在30。C攪拌，直至HPLC顯示反應(yīng)完成。然后將所述反應(yīng)混合物冷卻至5°C以下，并緩慢加入預(yù)冷水(8體積，4568mL)保持所得漿體溫度低于10°C。將懸浮液攪拌30分鐘，然后過濾并用25%乙醇/水洗滌2次(每次2284mL,4體積)。通過在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它類似溶劑混合物中重新制漿以去除殘留哌啶和哌啶二千基富烯。如圖3所示，產(chǎn)物為分離的肽片段H-AA(27-38)-NH2制劑。如圖3說明，進(jìn)行液相反應(yīng)，其中肽片段H-AA(27-38)-NH2(SEQIDNO:20)與肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(SEQIDNO:18)組合，并去保護(hù)產(chǎn)生肽片段H-AA(13-38)-NH2(SEQIDNO:35，在N端和C端都具有化學(xué)基團(tuán))。將肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(460g,167mmol，1當(dāng)量)、肽片段H-AA(27-38)-NH2(460g，172mmol，1.03當(dāng)量)、和6國C1HOBT(34g,200mmol，1.2當(dāng)量)加入到DMF(6900ml，15體積)中，用DIEA(47ml,267mmol"1.6當(dāng)量)處理，并攪拌以溶解所有固體。將所得溶液冷卻至5。C以下。向反應(yīng)中加入TBTU(64g，200mmo1,1.2當(dāng)量)，且將反應(yīng)在0。C攪拌，然后在25t攪拌。一旦HPLC分析顯示所述反應(yīng)完成，加入哌咬(58ml,668mmol，4當(dāng)量)以去除Fmoc，然后攪拌所述反應(yīng)直至HPLC顯示反應(yīng)完成。將溶液冷卻至5。C以下，并以一定速率緩慢加入水(6900mL,15體積)使得溫度不會升到10°C以上。將所得懸浮液攪拌30分鐘后，通過過濾收集固體并用水洗滌(2次，每次2300mL，5體積)并干燥。通過在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它類似溶劑混合物中重新制漿去除殘留哌啶和哌啶二千基富烯。通過過濾收集固體、洗滌、并干燥以產(chǎn)生基本純的白色固體H-AA(13-38)-NH2(SEQIDNO:35),由高效液相色譜(HPLC)純度分析確定。如圖3說明的，肽片段H-AA(13-38)-NH2(SEQIDNO:35)在液相反應(yīng)中與肽片段Ac-(l-12)-OH(SEQIDNO:17)組裝以產(chǎn)生具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(參見，例如圖3，Ac-(l-38)-NH2)。將肽片段Ac-AA(l-12)-OH(130g，58.5mmol,1當(dāng)量)研磨成細(xì)粉并與肽片段H-AA(13-38)-NH2(303g，58.5mmol,1當(dāng)量)混合。將所述混合物緩慢加入到2:1DCM/DMF(20體積，2600mL)和DIEA(25.5mL,146mmol,2.5當(dāng)量)溫?zé)崛芤褐?。加入HOAT(15.9g,117mmo1，2.0當(dāng)量)且攪拌所述混合物以溶解所有固體。將所得溶液冷卻至5t以下，并加入TBTU(28.2g，87.8mmol,1.5當(dāng)量)。將溶液在0。C攪拌30分鐘，然后在25。C攪拌，直至HPLC顯示反應(yīng)完成。將所述溶液加熱到30-35°C，并加入額外的DCM(13體積，1740mL)和水(1820mL，14體積)。將所迷混合物攪拌5分鐘，然后允許分層。去除水層并替換為新鮮水(1820ml，14體積)。分層重復(fù)總計(jì)5次。將有機(jī)層蒸熘至原體積的1/3,并加入異丙醇(IPA;1820ml，14體積)。繼續(xù)蒸餾以去除殘留DCM。將所得漿體冷卻至5。C以下，并緩慢加入水(1820ml，14體積)。形成的固形通過過濾收集，用水洗滌2次(每次520mL，4體積)，并干燥以產(chǎn)生分離的fflV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:9)制劑，由HPLC純度分析確定。如圖3所示，可通過酸解或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它通過去除側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基團(tuán)將肽去保護(hù)的方法去除HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2的側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基團(tuán)。在本實(shí)施例中，HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(60g,8.1mmol)用TFA(三氟乙酸)DDT(二疏蘇糖醇)水(90:10:5;570ml)處理，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將該溶液冷卻至10。C以下，并以一定速率緩慢加入預(yù)冷MTBE(25體積，1500ml)使得溫度保持低于10°C。生成的固體通過過濾收集，用MTBE洗滌，并干燥。然后將所得粉末在乙腈(ACN;10體積，600mL)中制漿，用DIEA和乙酸調(diào)節(jié)pH至4到5之間，以使所述肽脫羧基。一旦HPLC顯示所述反應(yīng)完成，通過過濾收集固體，用ACN洗滌，并干燥以產(chǎn)生去保護(hù)且脫羧基的肽制劑，然后所述肽制劑通過HPLC或其它合適的色譜技術(shù)純化，以產(chǎn)生具有SEQIDNO:9氨基酸序列的分離的fflV融合抑制肽制劑。實(shí)施例6參考表5(組3和組4)和圖4，說明了使用2個(gè)特定肽片段(例如SEQIDNO:29和30+Leu;或SEQIDNO:29和31)并使用片段組裝法合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，所述片段組裝法包括將2個(gè)肽片段通過化學(xué)結(jié)合("組裝")進(jìn)行組合以生成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。每種所述肽片段顯示出的物理性質(zhì)和溶解度特性使所迷肽片段成為優(yōu)選肽片段，用于使用2個(gè)肽片段以高產(chǎn)量和高純度合成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中。在選擇用于二片段組裝方法的肽片段時(shí)，發(fā)現(xiàn)在被組裝的2個(gè)片段之間的接合點(diǎn)(例如，具有SEQIDNO:29氨基酸序列的肽片段C端，和具有SEQIDNO:31氨基酸序列的肽片段N端)具有亮氨酸和/或谷氨酸有利于以高產(chǎn)量組裝和獲得的純度水平。通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成具有SEQIDNO:29氨基酸序列并包含SEQIDNO:9前20位氨基酸("AA(l-20)")的肽片段，所述片段N端乙酰化("Ac"，作為化學(xué)基團(tuán))，c端具有羥基(-OH)(參見圖6;本文中也被稱為"Ac-AA(l-20)-OH")。通過標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成具有SEQIDNO:30氨基酸序列并包含SEQIDNO:9中第21-37位氨基酸("AA(21-37)")的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán))，C端具有-OH(參見圖6;本文中也被稱為"Fmoc-AA(21-37)-OH")。如表5組3和組4以及圖4所示，通過液相合成制備肽片段，其中肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH化學(xué)結(jié)合到已在液相中酰胺化的SEQIDNO:9第38位氨基酸亮氨酸上以生成具有SEQIDNO:31氨基酸序列的肽片段(包含SEQIDNO:9中第21-38位氨基酸)，所述肽片段C端酰胺化(作為化學(xué)基團(tuán))("Fmoc-AA(21-38)-NH2")。為了在液相過程中使用肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH與亮氨酸("H-Leu-NH2")組合制備肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2，將肽片段Fmoc國AA(21-37)-OH(30g,7.43mmol,1.0當(dāng)量)、H-Leu-NH2*HC1(1.36g,8.16mmol,1.2當(dāng)量)、和HOAT(1.52g,11.2mmol,1.5當(dāng)量)溶解于DMF(450ml,15體積)中，用DIEA(6.5ml,37.3mmol，5當(dāng)量)處理并在室溫?cái)嚢柚敝寥芙?約30分鐘)。將該溶液冷卻至0±5°C，并加入TBTU(2.86g，8.91mmol，1.2當(dāng)量)，在0土5t攪拌5分鐘，然后在25士5。C反應(yīng)2小時(shí)或直至HPLC顯示反應(yīng)完成。在分離片段H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fmoc化學(xué)保護(hù)基團(tuán)。加入派啶(7.3mL,73.8mmol,10當(dāng)量)，且將所述溶液在25士5。C攪拌1小時(shí)或直至HPLC分析顯示基本所有Fmoc從所述肽片段去除。冷卻反應(yīng)器，加入水(1000ml,30體積)，在10。C以下攪拌自由流動的漿體30分鐘，然后通過過濾分離。用1:1乙醇/水洗滌收集的固體，并在真空爐中在35±5°C干燥。然后將肽片段在1:1乙醇/水(450mL,15體積)中重新制漿3小時(shí)。收集并干燥固體。然后所述肽片段在3:1正己烷:MTBE(450mL,15體積)中制漿過夜，然后通過過濾分離并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制漿可重復(fù)以去除多余的哌啶。所得產(chǎn)物是分離的肽片段H-AA(21-38)-NH2制劑(參見圖4)。然后進(jìn)行了液相反應(yīng)，其中將肽片段H-AA(21-38)-NH2(SEQIDNO:31)與肽片段Ac-AA(1-20)-OH(SEQIDNO:29)組合，以生成具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(參見圖4，Ac-(l-38)-NH2)。將肽片段H-AA(21-38)-NH2(3.40g，0.86mmol，1當(dāng)量)、肽片段Ac畫AA(l-20)國OH(3.00g,0.86mmol，1.0當(dāng)量)、以及HOAT(0.177g，1.3mmol，1.5當(dāng)量)和DIEA(0.599ml,3.44mmol,4當(dāng)量)溶解于DMAc(二甲基乙酰胺；100ml，33體積)，冷卻至0±5。C。向反應(yīng)中加入TBTU(0.331g,1.03mmol,1.2當(dāng)量)。將所述反應(yīng)在0±5°C攪拌5分鐘，并在25士5。C攪拌3小時(shí)或直至HPLC顯示所述反應(yīng)完成。冷卻反應(yīng)器，緩慢加入水(200ml，66體積)。形成漿體并在10。C以下攪拌至少30分鐘。固體通過過濾分離并用另外的水洗滌。在真空爐中在35士5。C干燥收集的固體。所得產(chǎn)物是完全保護(hù)的、分離的HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:9)制劑，由HPLC純度分析確定。然后使用本發(fā)明實(shí)施例5所述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它去保護(hù)和脫羧基方法酸殘基)，然后純化(例如通過HPLC)。所得產(chǎn)物是具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽(在本說明中，N端乙?；?，C端酰胺化)制劑(去保護(hù)且脫羥基的)。使用相似的技術(shù)和條件，使用其它涉及2個(gè)片段組裝或3個(gè)片段組裝的片段組裝法制備具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽(參見，例如表4和5)。從本文描迷應(yīng)理解，用于通過本發(fā)明的方法制備具有SEQIDNO:9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的優(yōu)選肽片段可用于排除優(yōu)選肽片段以外的肽片段。同樣地，用于通過本發(fā)明的方法制備具有SEQIDNO:9氨基酸序列的fflV融合抑制肽的優(yōu)選肽片,殳組可用于朝f除優(yōu)逸肽片卓艾組。實(shí)施例7本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及可用于合成具有SEQIDNO:10氨基酸序列的fflV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段組。從本文描述中還顯而易見的是，所述方法、肽片段、和肽片段組可用于合成具有SEQIDNO:10氨基酸序列的fflV融合抑制狀，其中所述HIV融合抑制肽包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>NO:IO氨基酸序列的fflV融合抑制肽的方法中作為中間體。本發(fā)明提供的肽片段組包括表8所示的組1-14(組的編號只為描述方便)。某些肽片段組可用于排除其它肽片段組。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>參考表8(組3和組4)，說明了使用2個(gè)特定肽片段(例如SEQIDNO:29和48+Leu;或SEQIDNO:29和49)并使用片段組裝法合成具有SEQIDNO:10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，所述片段組裝法包括通過化學(xué)結(jié)合("組裝")組合2個(gè)肽片段以制備具有SEQIDNO:10氨基酸序列的fflV融合抑制肽。為了在液相過程中使用具有SEQIDNO:48的肽片段("Fmoc-AA(21-37)-OH")與亮氨酸("H-Leu-NH/)組合制備具有SEQIDNO:49的肽片段("Fmoc-AA(21-38)-NH2")，將肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH(30.01g,7.98mmol,1.0當(dāng)量)、H-Leu-NH2*HC1(1.48g,8.78mmol，1.1當(dāng)量)、和HOAT(1.63g,11.97mmol，1.5當(dāng)量)溶于DMF(450ml,15體積)中，用DIEA(7.0ml,39.91mmol,5當(dāng)量)處理并在室溫?cái)嚢柚敝寥芙?約30分鐘)。將所述溶液冷卻至0±5°C，并加入TBTU(3.09g，9.58mmol,1.2當(dāng)量)，在0±5°C攪拌5分鐘，然后在25i5。C反應(yīng)2小時(shí)或直至HPLC顯示所述反應(yīng)完成。在分離片段H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fmoc化學(xué)保護(hù)基團(tuán)。加入派咬(8.0ml，79.8mmol,10當(dāng)量)，并將所述溶液在25士5。C攪拌1.5小時(shí)或直至HPLC分析顯示基本所有Fmoc都被從所述肽片段去除。將反應(yīng)器冷卻，加入水(IOOOml,30體積)，在10。C以下攪拌自由流動的懸浮液30分鐘，然后通過過濾分離。收集的固體用1:3乙醇/水洗滌，并在真空爐中于35士5。C干燥。然后將肽片段在1:3乙醇/水(400mL,13體積)中重新制漿3小時(shí)。收集并干燥固體，然后將所述肽片段在3:1正己烷:MTBE(400mL,13體積)中制漿過夜，通過過濾分離并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制漿可重復(fù)以去除多余的哌啶。所得產(chǎn)物是分離的肽片段H-AA(21-38)-NH2制劑(參見表9,SEQIDNO:49)。然后進(jìn)行液相反應(yīng)，其中肽片段H-AA(21-38)-NH2(SEQIDNO:49)與肽片段Ac-AA(l-20)-OH(SEQIDNO:29,表9)結(jié)合，以生成具有SEQIDNO:10氨基酸序列的fflV融合抑制肽(參見，例如Ac-(l-38)-NH2)。將肽片段H-AA(21-38)-NH2(3.14g，0.86mmol,1當(dāng)量)、肽片#更Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol,1.0當(dāng)量)、以及HOAT(0.18g，1.3mmol,1.5當(dāng)量)和D正A(0.599ml,3.44mmol,4當(dāng)量)溶解于DMAc(lOOml,33體積)，冷卻至0±5°C。向反應(yīng)中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2當(dāng)量)。將所述反應(yīng)在0士5。C攪拌5分鐘，并在25i5。C攪拌3小時(shí)或直至HPLC顯示所述反應(yīng)完成。冷卻反應(yīng)器，緩慢加入水(250ml，83體積)。漿體形成并在10°C以下攪拌至少30分鐘。固體通過過濾分離并用額外的水洗滌。收集的固體在真空爐中于35士5t干燥。所得67產(chǎn)物是完全保護(hù)的、分離的fflV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2(SEQIDNO:IO)制劑，由HPLC純度分析確定。然后使用本發(fā)明實(shí)施例4所述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它去保護(hù)和脫羧基方法對所述HIV融合抑制肽Ac-AA(l-38)-NH2去保護(hù)(通過去除側(cè)鏈化學(xué)保護(hù)基團(tuán))并脫羧基(在色氨酸殘基)。純化后，所得產(chǎn)物是分離的具有SEQIDNO:10氨基酸序列的fflV融合抑制肽(N端乙?；珻端酰胺化)制劑(去保護(hù)且脫羥基的)，由HPLC確定。使用相似的技術(shù)和條件，使用其它涉及2個(gè)片段組裝或3個(gè)片段組裝的片段組裝法制備具有SEQIDNO:IO氨基酸序列的fflV融合抑制肽(參見，例如表8和9)。從本文描述應(yīng)理解，用于通過本發(fā)明提供的方法制備具有SEQIDNO:IO氨基酸序列的fflV融合抑制肽的肽片段可用于排除其它肽片段。同樣地，用于通過本發(fā)明提供的方法制備具有SEQIDNO:IO氨基酸序列的fflV融合抑制肽的肽片段組可用于排除其它肽片段組。實(shí)施例8本發(fā)明進(jìn)一步才是供了施用抗病毒肽例如HIV融合抑制肽(該肽本身或作為本發(fā)明才是供的組合物中的活性藥物物質(zhì))治療HIV感染和/或AIDS或作為fflV感染和/或AIDS治療方案的一部分的方法。fflV融合抑制肽的抗病毒活性可用于抑制HIV向耙細(xì)胞傳遞的方法，所述方法包含使病毒和/或細(xì)胞與一定量的fflV融合抑制肽，所述量有效抑制細(xì)胞HIV感染，更優(yōu)選地，有效抑制HIV介導(dǎo)的病毒與耙細(xì)胞的融合。所述方法可用于治療fflV感染患者(治療用)或治療剛剛暴露于或有高風(fēng)險(xiǎn)暴露于(例如，通過用藥或高風(fēng)險(xiǎn)性行為)HIV的患者(預(yù)防用)。因此，例如，在fflV-l感染患者的例子中，有效量的HIV融合抑制肽是足以(通過該肽本身和/或與多劑量方案結(jié)合)降低所治療患者體內(nèi)HIV病毒載量的劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，有多種測定fflV病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于，通過外周血單核細(xì)胞定量培養(yǎng)和通過血漿HIVRNA測量。所迷fflV融合抑制肽可單次地、間歇地、定期地、或連續(xù)地施用，施用方式由醫(yī)務(wù)人員確定，例如通過監(jiān)測病毒載量。根據(jù)本發(fā)明提供的包含HIV融合抑制肽的特定組合物，以及諸如本發(fā)明提供的特定組合物是否進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受載體和/或大分子載體等因素，HIV融合抑制肽可以以數(shù)天到數(shù)周或可能更長的周期施用。另外，HIV融合抑制肽在抗病毒治療中可與其它用于治療HIV的抗病毒藥物或預(yù)防藥劑組合使用或用于治療方案(例如，同時(shí)使用、或交替與一種藥物和另一種藥物組合)中。一種常用的涉及抗病毒劑組合的治療被稱為HAART(高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)。HAART典型地組合3種或更多種具有抗fflV抗病毒活性的藥物，并典型地涉及多于一類的藥物("類"涉及作用機(jī)制、或藥物靶向的病毒蛋白或過程)。因此，本發(fā)明提供的包含fflV融合抑制肽的組合物可單獨(dú)施用(例如作為單一療法)或在治療方案中施用、或共同施用，所述共同施用涉及用于治療HIV感染和/或AIDS的其它治療劑的組合，如本文詳述。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種治療劑可在治療中在本發(fā)明提供的組合物中與Hiv融合抑制肽組合。這些組合除所述mv融合抑制肽以外可包含至少一種抗病毒劑。這些組合可以，例如由目前批準(zhǔn)的或?qū)砼鷾?zhǔn)的有效劑量的抗病毒劑(用于治療HIV感染)制備，所述抗病毒劑包括但不限于選自以下藥劑的一種或多種其它治療劑抗病毒劑例如細(xì)胞因子，例如rIFNa、rIFNp、rIFNy;逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，包括但不限于，阿巴卡韋、AZT(齊多夫定)、ddC(扎西他賓)、奈韋拉平、ddl(地達(dá)諾新)、FTC(恩曲他濱)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS840、GW誦1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韋定、依法韋侖、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韋、泰洛福韋、和阿洛夫定；蛋白酶抑制劑，包括但不限于，安普那韋、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韋、那非那韋、PNU-140690、利托那韋、沙奎那韋、替利那韋、替4立那韋、阿扎那韋、洛匹那韋、ABT378、ABT538和MK639;病毒mRNA加帽抑制劑，例如利巴韋林；作為具有抗HIV活性的脂質(zhì)結(jié)合分子的兩性霉素B;作為糖蛋白加工抑制劑的澳粟精胺；病毒進(jìn)入抑制劑，例如融合抑制劑(恩夫韋地、T1249、其它融合抑制肽，以及小分子)、SCH-D、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(TanoxInc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro140、Pro542(Progenies)、FP-21399(EMDLexigen)、BMS806、BMS畫488043(Bristol-MyersSquibb)、馬拉維若(UK-427857)、ONO-4128、GW畫873140、AMD國887、CMPD-167、和GSK-873、140(GlaxoSmithKline);CXCR4拮抗劑，例如AMD-070;脂質(zhì)和/或膽固醇相互作用調(diào)節(jié)劑，例如鹽酸普魯卡因(SP-01和SP-01A);整合酶抑制劑，包括但不限于，L-870和810;RNA酶H抑制劑；rev或REV抑制劑；vif抑制劑(例如源于vif的富含脯氨酸的肽、源于fflV-l蛋白酶N端的肽)；病毒加工抑制劑，包括但不限于，樺木醇和二氬樺木醇衍生物(例如PA-457);以及免疫調(diào)節(jié)劑，包括但不限于，AS-101、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸腺噴丁。如fflV感染和/或AIDS治療領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，組合藥物治療可包含兩種或多種具有相同作用機(jī)制的治療劑，或可包含兩種或多種具有不同作用機(jī)制的治療劑。它治療劑的有效劑量是本領(lǐng)域已知的。而且，本發(fā)明提供的fflV融合抑制肽或藥物組合物的施用有效劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法確定，例如通過確定效力、生物半衰期、生物利用度、和毒性來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)體外和體內(nèi)研究數(shù)據(jù)確定fflV融合抑制肽的有效劑量和劑量范圍。例如，諸如本發(fā)明所述的抗病毒與其它活性成分組合)抑制預(yù)定范圍的病毒感染性(例如50%抑制，IC5o;或90%抑制，IC90)或抑制病毒復(fù)制所需要的平均抑制濃度(IC)。然后本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用一種或多種標(biāo)準(zhǔn)模型的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)來選擇合適的劑量，由此得到等于或超過抑制病毒感染性或病毒復(fù)制的預(yù)定值的所述活性成分的最小血漿濃度(C^in)。雖然劑量范圍典型地依賴于選擇的施用途徑和劑量配方，當(dāng)施用時(shí)，例如施用途徑包括但不限于，皮下、腸胃外、皮內(nèi)或口服，作為活性成分的化合物的示例性劑量范圍可從約1mg/kg體重到約100mg/kg體重；且更優(yōu)選地從不低于1mg/kg體重到不超過10mg/kg體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過注射(使用例如皮下注射)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用HIV融合抑制肽。因此，4是供了抑制fflV向細(xì)胞傳遞的方法，所述方法包括施用本發(fā)明所述的組合物，所述組合物包含抑制細(xì)胞fflV感染的有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可進(jìn)一步包括向患者組合施用本發(fā)明所述的組合物與其它用于治療fflV感染和/或AIDS的治療劑，所述方法是向個(gè)體施用包含有效量的本發(fā)明才是供的fflV融合抑制肽或藥物組合物的治療劑的組合(同時(shí)或先后，或治療方案的一部分)。還提供了抑制fflV進(jìn)入的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本發(fā)明所述的組合物，所述組合物包含抑制病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的有效量的fflV融合抑制肽。所述方法可進(jìn)一步包含組合施用本發(fā)明所述的組合物與有效量的一種或多種可用于治療HIV感染的其它抑制劑，例如病毒進(jìn)入抑制劑。實(shí)施例9制備本發(fā)明提供的組合物的方法如下詳述。另外，描述了示例性組合物。材料乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)來自EastmanChemicals。聚丙交酯(PLA)和聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)來自LakeshoreBiomateials。PLA和PLGA的區(qū)別在于丙交酯乙交酯比率、分子量和它們的末端基團(tuán)。本研究中使用的所有PLGA均為50.'50丙交酯:乙交酯。分子量以名稱中的數(shù)字分級。分子量估值為所述數(shù)字的10000倍。末端基團(tuán)是羧酸(A)、甲酯(M)或月桂醇酯(L)。N-甲基-2畫吡咯烷酮(NMP)來自Spectrum。苯甲酸千酯和三乙酸甘油酯來自Sigma。鹽酸胍來自Amresco。Tris-HCl來自Sigma。4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚來自Sigma。甲醇來自VWR。七水石克酸鋅來自Sigma。氯化鋅來自Sigma。T1144肽材料制備根據(jù)以下規(guī)程制備T1144肽材料。噴霧干燥將T1144肽在pH小于4或大于6時(shí)通常溶解在水中。使用1NNaOH或1NHC1調(diào)節(jié)pH。肽溶液通過噴霧嘴噴到加熱箱中。人工收集干燥的肽顆粒。肽可迸一步通過上述噴霧干燥方法制備，但向噴霧干燥溶液加入賦形劑，由此將賦形劑與肽結(jié)合。鹽沉淀或pH沉淀將肽在pH小于4或大于6下通常溶解在水中。使用1NNaOH或lNHCl調(diào)節(jié)pH。加入鹽溶液或強(qiáng)酸/堿以導(dǎo)致沉淀。沉淀物通過離心收集、凍干法干燥、并過200^im篩以控制顆粒大小。運(yùn)載體制備根據(jù)以下方法制備運(yùn)載體。SAIB運(yùn)載體制備將可達(dá)到所需終濃度的合適量SAIB加熱并加入到NMP中，混合均勻。SAIB/PLA運(yùn)載體制備將可達(dá)到所需終濃度的合適量PLA溶解于NMP、苯甲酸千酯或三乙酸甘油酯。將可達(dá)到所需終濃度的合適量SAIB加熱并加入到所述PLA溶液，混合均勻。PLA、PLG和PLGA運(yùn)載體制備將可達(dá)到所需PLA、PLG或PLGA終濃度的合適量PLA、PLG和PLGA溶解于NMP?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法制備組合物。在本實(shí)施例中，將肽材料(沉淀的或噴霧干燥的)加入到小瓶中。將運(yùn)載體加入到所述小瓶中，并將內(nèi)容物混合均勻。在某些情況下，需要加熱至約4(TC以確保正確混合。配方定量為肽重量/配方(以mg/g表示)。通過與Edelhoch方法相似的方式，根據(jù)色氨酸和酪氨酸吸收確定肽含量。簡單地說，將約1mg肽材料溶解在1mL8M鹽酸胍中。在276、280和288nm測定溶液的紫外吸收。使用這些測定的吸收值，以及已知的樣品重量、樣品體積、肽中色氨酸和酪氨酸殘基的數(shù)量、和肽分子量，確定固體中的肽含量(％w/w)。使用紫外/可見光吸收分析確定金屬陽離子含量，所述分析使用4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚(PAR),PAR是已知與M^形成2:l復(fù)合物的一種金屬顯色指示劑。簡單地說，將約1mg固體溶解于lmL包含6M鹽酸胍的Tris-HCl緩沖液(pH8)中。稀釋所述溶液(使用相同的緩沖液)使金屬陽離子終濃度為l-l(HiM。將50^10.1MPAR加入到950|iL稀釋溶液中。平衡后，在500nm測定測試溶液的紫外/可見光吸收。基于同一天獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性最小二乘分析計(jì)算金屬陽離子濃度，并確定樣品的金屬陽離子含量(wt%)。通過LC-MS分析確定血漿中的肽濃度。使用3倍體積的包含0.5%(v/v)上清液。使用梯度洗脫(10mM乙酸銨，pH6.8:乙腈，0.6mL/min)進(jìn)行色語法，共運(yùn)行6分鐘。在PhenomenexLunaC8(2)50X2mm柱上進(jìn)行分離，所述柱由4X2mmPhenomenexSecurityGuardC8保護(hù)柱保護(hù)。在SciexAPI4000或API4000Qtrap設(shè)備上進(jìn)行質(zhì)i普分析(ESI+)，通常使用單-四極模式，檢測[M+3H產(chǎn)或[M+4H廣離子。從30ng/mL到30ng/mL構(gòu)建TRI-1144校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為隨時(shí)間變化的血漿肽濃度。使用下列縮略語Cm狀二最大血漿肽濃度；tmax=Cmax的時(shí)間；t(n=血漿肽濃度下降到0.1^g/ml以下的時(shí)間；以及to.(H為標(biāo)準(zhǔn)化血漿肽濃度下降到0.01(xg/ml以下的時(shí)間。在某些情況下，為便于比較，血漿濃度標(biāo)準(zhǔn)化為3mg肽/千克動物體重。動物給藥方式如下。包含過量T1144的組合物通過16G針頭被吸入1cc注射器。用18G或21G針頭替換所述針頭，并且注射器排空至正確劑量。在動物肩胛骨之間的皮下區(qū)域給藥。大鼠(400g)給藥40(HiL，每個(gè)劑量組3只動物。獼猴(2.5kg)給藥400^或1000nL,每組3只動物。所有藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)收集自大鼠或猴子。在某些情況下，為便于比較，血漿濃度標(biāo)準(zhǔn)化為3mg肽/千克動物。制備了以下包含肽的組合物。T1144/鋅沉淀A.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.2并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22jxm濾器。將2mL0.1MZnS04加入到80mLT1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將所述沉淀凍干并通過200(xm篩。T1144/鋅沉淀B.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.2并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22pm濾器。將60mL0.1MZnSO4加入到120mLT1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將所述沉淀凍干并通過200nm篩。T1144/鋅沉淀C.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約5.7并加水至濃度為40mg/mL。將所述溶液通過0.22(im濾器。將〈100mgZnCb加入到20mLT1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并用lmL水洗滌沉淀。將所得沉淀冷凍、凍干并通過200|im篩oT1144/鋅沉淀D.用5mL水洗滌沉淀B,離心并棄上清。此步驟再重復(fù)2次。將所得沉淀冷凍、凍干并通過200|am篩。T1144/鋅沉淀E.將445mgZnSO/7H20溶于2mL水。將l.Og沉淀D在鋅溶液中制漿。將漿體冷凍、凍干并通過200pm篩。T1144/鋅沉淀F.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.2并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22拜濾器。加入5mL1N乙酸，降低pH至約5。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過20(Him篩。T1144/鋅沉淀G.將230mgZnS04*7H20溶于2mL水。將500mg沉淀F在鋅溶液中制漿。將漿體冷凍、凍干并通過20(Him篩。T1144/鋅沉淀H.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約8.4并加水至濃度為50mg/mL。將所述溶液通過0.22|im濾器。加入甲醇至濃度為25mg/mL(50:50甲醇:水)。將約lmL0.1MZnS04加入到20mLTRI-1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過200nm篩。T1144/鋅沉淀L將TRI-1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約8.4并加水至濃度為50mg/mL。將所述溶液通過0.22(xm濾器。加入甲醇至濃度為25mg/mL(50:50甲醇:水)。調(diào)節(jié)pH至約5。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過200拜歸。T1144/鋅沉淀J.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.2并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22jim濾器。將60mL0.1MZnS04加入到120mLT1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過150(im歸。T1144/鋅沉淀K.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.2并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22阿濾器。將lmL0.1MZnS04加入到40mLT1144溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過150pm歸。T1144/鋅沉淀L.用30mL水洗滌l.Og沉淀J，離心并棄上清。此步驟再重復(fù)1次。將所得沉淀冷凍、凍干并通過200pm篩。T1144/鋅沉淀M.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.3并加水至濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22pm濾器。將25mLT1144溶液通過噴霧嘴(方式與噴霧干燥相似)噴到50mL劇烈混合的0.3MZnS04溶液中。將所得懸浮液離心，棄上清，并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過150pm篩。T1144/鋅沉淀N.將T1144溶于水。調(diào)節(jié)pH至約6.3并加水至濃度為50mg/mL。加入甲醇至T1144溶液終濃度為25mg/mL。將所述溶液通過0.22jxm濾器。將25mLT1144溶液通過噴霧嘴(方式與噴霧干燥相似)噴到50mL劇烈混合的0.1MZnS04溶液中。將所得懸浮液離心并棄上清。用10mL水洗滌沉淀3次。將懸浮液離心，棄上清并冷凍沉淀。將沉淀凍干并通過200拜篩。表9:肽材料組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>以下述方式將上述組合物施用于大鼠或猴子。在大鼠或猴子中獲得的結(jié)果預(yù)期與人的結(jié)果合理相關(guān)聯(lián)。沉淀D在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中配制為100mg/g，并對獼猴給藥1000pL。如圖5(——)所示，血漿濃度持續(xù)12天高于lpg/mL的目標(biāo)值，超過了7天的目標(biāo)時(shí)間。沉淀J在40:60的PLA3:NMP中配制為50mg/g，并對獼猴給藥400jLiL。如圖5(—■—)所示，血漿濃度持續(xù)7天高于ljig/mL的目標(biāo)值；更大劑量，例如100(HiL100mg/g沉淀J，可能持續(xù)10-12天產(chǎn)生目標(biāo)血漿濃度。這表明T1144可在SAIB/PLA或PLA運(yùn)載體中皮下遞送，并持續(xù)超過一周提供超過目標(biāo)值(即lpg/mL)的血漿濃度。沉淀D在74:11:15的SAIB:PLA3L:NMP中配制為100mg/g，并對大鼠給藥400pL。如圖6(--)所示，血漿濃度持續(xù)6天高于lpg/mL的目標(biāo)值，接近符合7天的目標(biāo)時(shí)間。沉淀J在40:60的PLA3:NMP中配制為50mg/g，并對大鼠給藥400nL。如圖6(—■—)所示，血漿濃度持續(xù)7天高于l^g/mL的目標(biāo)值。這表明所述制劑在嚙齒動物和靈長動物模型中提供了相似的T1144持續(xù)遞送。SAIB:PLA比率對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀A在SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400|xl。如圖7所示，降低SAIB:PLA比率(即更多的PLA)可降低C隨、增加t隨并增加t謹(jǐn)。將沉淀B也在SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400pl。如圖8和9所示，結(jié)果與沉淀A呈現(xiàn)的結(jié)果在性質(zhì)上相似。但是，SAIB:PLA比率影響沉淀B遞送的程度低于其對沉淀A遞送的影響。這表明降低SAIB:PLA比率可改善T1144的持續(xù)遞送，并且沉淀性質(zhì)，尤其是沉淀中的鋅含量，可影響遞送率?；|(zhì)溶劑比率對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀B在SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400pl。如圖10所示，相對于更低的PLA水平，10X左右的PLA水平可減緩肽遞送。溶劑類型對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀B在75:5:20的SAIB:PLA3M:溶劑(即三乙酸甘油酯、苯甲酸千酯或NMP)運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400^1。如圖11所示，由于溶劑類型改變，Qnax降低、tmax增加且to.(H增加。NMP可提供比三乙酸甘油酯更理想的藥代動力學(xué)性質(zhì)，三乙酸甘油酯比苯甲酸千酯表現(xiàn)更好。這表明溶劑類型可影響肽遞送。肽濃度對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀B在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)載體中配制并對大鼠給藥400nl。結(jié)果如圖12所示，并表明，在該運(yùn)載體中，提高肽濃度對肽遞送沒有不利影響。注射體積對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀B在74:11:15的SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)栽體中配制為100mg/g并對大鼠給藥。如圖13所示，劑量體積對持續(xù)遞送參數(shù)沒有顯著影響；但是，400pl劑量比200pl劑量表現(xiàn)更好一些(全部標(biāo)準(zhǔn)化)。將沉淀C在77:15:8的SAIB:NMP:乙醇運(yùn)載體中配制并對大鼠給藥。如圖13所示，當(dāng)控制肽劑量時(shí)，最初3天劑量體積對持續(xù)遞送參數(shù)沒有顯著影響；但是，3天以后，400nl劑量比200pl劑量表現(xiàn)更好一些。這表明增加注射體積可促進(jìn)持續(xù)遞送。SAIB運(yùn)載體中的PLA類型對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀A在75:5:20的SAIB:PLA:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400pl。如圖14所示，PLA類型從3L改變?yōu)?M可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。這表明PLA類型可影響持續(xù)遞送。肽沉淀形式對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀A、B、E和G在75:5:20的SAIB:PLA3M:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400pl。如圖15所示，在起始沉淀過程中增加鋅含量可降低Cmax、增加tmax并增加to.(),(A和B)。向低鋅沉淀中加入疏酸鋅作為凍千鹽可降低Cmax、增加tmax并增加to.(n(A和E)。當(dāng)最終沉淀包含疏酸鋅作為凍干鹽時(shí)，用鋅沉淀代替pH沉淀并未影響持續(xù)遞送參數(shù)(E和G)。即使總鋅含量相似，在此運(yùn)載體中，沉淀E和G都不如沉淀B表現(xiàn)好。這表明鋅結(jié)合進(jìn)沉淀的方式(例如，如何沉淀或噴霧)顯著地影響肽的持續(xù)遞送。聚合物類型和劑量體積在猴子體內(nèi)對藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響。沉淀D在SAIB:PLA:NMP賦形劑中配制并對獼猴給藥。如圖16所示，賦形劑從75:5:20改變?yōu)?4:11:15(400pl劑量)并未顯著影響持續(xù)遞送參數(shù)；但是，兩者都比水溶液表現(xiàn)更好。增加74:11:15的劑量體積到1000pl可降低C隨、減少t隨并增加to.w。這表明改變劑量體積可影響持續(xù)遞送。PLA和PLGA凝膠系統(tǒng)基質(zhì)溶劑比率對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀A和D分別在PLGA1A:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400|xl。如圖17所示，提高基質(zhì):溶劑比率(更多PLGA)可降低C隨、增加tmax并增加t麵。這表明運(yùn)載體中聚合物的量可影響持續(xù)遞送。聚合物類型對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀A和D分別在聚合物:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400pl。如圖17所示，提高聚合物分子量和L:G比率可同時(shí)降低Cm狄、增加tmax并增加to.(H。將沉淀B在聚合物:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400nl。如圖18所示，提高L:G比率可降低Cmax、增加tm狀并增加to.(u。提高聚合物分子量可降低Cmax、增加tmax并增加ta01。這表明運(yùn)載體中的聚合物類型可影響持續(xù)遞送。溶劑類型對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀B在PLGA1A:溶劑運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400^1。如固18所示，溶劑從NMP改變?yōu)槿宜岣视王ブ辉黾觮o川。這表明運(yùn)載體中的溶劑類型可影響持續(xù)遞送。肽濃度對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀B在50:50的PLGA1A:NMP運(yùn)載體中配制并對大鼠給藥400pl。如圖19所示，增加劑量可降低Cmax、增加tmax并減少to.(H(全部標(biāo)準(zhǔn)化)。沉淀H在40:60的PLA3L:NMP運(yùn)栽體中配制并對大鼠給藥400pl。如圖19所示，增加劑量可降低Cmax、增加Uax并減少to.(H(全部標(biāo)準(zhǔn)化)。這表明PLA和PLGA運(yùn)載體可提供高劑量肽的持續(xù)遞送。肽形式(無鋅)對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀I和噴霧干燥材料在40:60的PLA3L:NMP運(yùn)載體中配制為50mg/g并對大鼠給藥400|_il。如圖20所示，改變不含鋅的肽形式并未改變持續(xù)遞送參數(shù)。這表明不含鋅的肽的物理形式并不顯著影響持續(xù)遞送。肽形式對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將沉淀H、J、K和L在40:60的PLA3L:NMP賦形劑中配制為50mg/g并對大鼠給藥400(xl。如圖21所示，洗滌沉淀，由此降低鋅含量，并未改變持續(xù)遞送參數(shù)(J和L)。洗滌的沉淀與未洗滌的低鋅沉淀的行為方式確實(shí)顯著不同(K和L)。從50:50的甲醇:水溶液中沉淀導(dǎo)致降低的Cmax和增加的tm狀。這表明在該運(yùn)載體中，與肽共同沉淀的鋅的量并不影響持續(xù)遞送；但是，沉淀出肽的溶液顯著影響遞送。陽離子類型對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.將多種鈣和鐵沉淀在40:60的PLA3L:NMP運(yùn)載體中配制并對大鼠給藥400nl。如圖22所示，所有制劑顯示了一定的持續(xù)遞送，其中鐵制劑比鈣制劑表現(xiàn)更好。這表明除鋅以外的其它陽離子沉淀可^是供肽的持續(xù)遞送。聚合物類型和肽形式對猴的藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀在聚合物:NMP運(yùn)載體中配制并對獼猴給藥。如圖23所示，將40:60的PLGA1A:NMP運(yùn)載體和沉淀A同時(shí)改變?yōu)?0:60的PLA3L:NMP運(yùn)載體和沉淀J可降低Cmax、減少tmax并增加to.01。這表明聚合物性質(zhì)(例如類型和分子量)和肽的制備方式對持續(xù)遞送有重要意義。沉淀方法對大鼠藥代動力學(xué)性質(zhì)的影響.沉淀H、J、M和N分別在40:60的PLA3L:NMP運(yùn)載體中配制并對大鼠給藥400pl。如圖24所示，標(biāo)準(zhǔn)沉淀J和H分別是噴霧沉淀M和N的類似物(即具有相似的肽和鋅含量)。在每種情況下，噴霧沉淀顯示出增加的Cm狀和、ax。噴霧沉淀在一周結(jié)束時(shí)的血漿濃度高于或等于標(biāo)準(zhǔn)沉淀的血漿濃度。這表明與標(biāo)準(zhǔn)沉淀相比，噴霧沉淀可提供改善的持續(xù)遞送潛力。為了說明目的，對本發(fā)明提供的特定實(shí)施方案的前述描述已經(jīng)被詳細(xì)說明。根據(jù)描述和說明，本領(lǐng)域其它技術(shù)人員可以通過應(yīng)用現(xiàn)有知識，在不違背基本概念的情況下，容易地為多種用途修改和/或調(diào)整所述實(shí)施方案；因此，這些修改和/或調(diào)整應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書的含義和范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.包含溶劑、膠凝材料和生物活性分子的組合物，其中在施用于患者后，所述組合物形成基質(zhì)并在施用12小時(shí)內(nèi)提供至少10μg/ml的所述生物活性分子的Cmax，然后以至少1μg/ml的血漿水平持續(xù)釋放至少7天。2.包含溶劑、膠凝材料和肽的組合物，其中所述肽選自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的組合。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述溶劑為NMP。4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料為SAIB。5.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料為PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。6.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所迷膠凝材料的存在量為30%到85%重量。7.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料的存在量為30%到80%重量。8.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料的存在量為30%到70%重量。9.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料的存在量為60%到85%重量。10.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料的存在量為65%到85%重量。11.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料的存在量為75%到85%重量。12.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述肽為T1144。13.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述組合物在施用12小時(shí)內(nèi)提供至少10pg/ml的所述生物活性分子的Cmax，然后以至少1pg/ml的血漿水平持續(xù)釋放至少7天。14.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種其它生物活性分子。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述其它生物活性分子為抗病毒劑。16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述抗病毒劑為肽。17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述抗病毒劑為細(xì)胞因子。18.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述抗病毒劑為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。19.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述抗病毒劑為病毒mRNA加帽抑制劑。20.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述膠凝材料為選自PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖的兩種或多種材料的混合物。21.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述肽溶解于所述溶劑和膠凝材料中。22.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述肽懸浮于所述溶劑和膠凝材料中。23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述懸浮的肽為噴霧干燥形式。24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鹽的噴霧干燥形式。25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鋅的噴霧干燥形式。26.如權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鈣的噴霧干燥形式。27.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述懸浮的肽為沉淀形式。28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鹽的沉淀形式。29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鋅的沉淀形式。30.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鈣的沉淀形式。31.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述懸浮的肽為包含鐵的沉淀形式。32.在患者體內(nèi)持續(xù)釋放肽的方法，其中所述方法包括向患者施用包含溶劑、膠凝材料和肽的組合物，其中所述肽選自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的組合。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述組合物通過皮下注射施用。34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述溶劑為NMP。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述膠凝材料為SAIB。36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述膠凝材料為PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述肽為T1144。38.改善HIV感染相關(guān)癥狀的方法，其中所述方法包括向HIV感染患者施用包含溶劑、膠凝材料和肽的組合物，其中所述肽選自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述狀的組合。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述組合物通過皮下注射施用。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述溶劑為NMP。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述膠凝材料為SAIB。42.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述膠凝材料為PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。43.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述肽為T1144。44.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種其它生物活性分子。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述其它生物活性分子為抗病毒劑。46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗病毒劑為肽。47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗病毒劑為細(xì)胞因子。48.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗病毒劑為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗病毒劑為病毒mRNA加帽抑制劑。全文摘要本發(fā)明提供了組合物及其作為治療劑施用的方法。尤其是，本發(fā)明提供了組合物及其在抗病毒肽治療劑施用中的用途。文檔編號A61K47/48GK101678125SQ200880018701公開日2010年3月24日申請日期2008年4月2日優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日發(fā)明者大衛(wèi)·海爾曼,布萊恩·L·布雷,彼得·西林斯基,斯科特·韋伯,杰邸申請人:特里梅里斯公司