專利名稱：甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及免疫學(xué)將免疫靶向治療載體與甲型流感病毒保守短肽M2e偶聯(lián)形成的綴合物。所述綴合物能交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊。
背景技術(shù)：
制備通用流感疫苗是目前流感疫苗研究的熱點(diǎn)。流感是一種嚴(yán)重危害人類健康的急性呼吸道傳染病，接種流感疫苗是最有效的防護(hù)手段。目前生產(chǎn)的流感疫苗主要針對誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)但是有兩個(gè)因素制約了季節(jié)性流感疫苗在防控流感大流行中的應(yīng)用:一個(gè)是疫苗株與流行毒株是否匹配的問題，因?yàn)榧竟?jié)性流感疫苗主要通過誘發(fā)血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA的抗體起免疫保護(hù)，毒株不匹配就不會有好的保護(hù)效果；另一個(gè)是從確定疫苗毒株到最終獲得疫苗所需的較長周期和對雞胚的依賴。因此，利用甲型流感病毒的保守抗原，研制不同亞型間具有交叉保護(hù)作用的廣譜流感疫苗，就成為流感疫苗研究的重要內(nèi)容。甲型流感病毒基質(zhì)蛋白2 (Mat rixprotein 2，M2)是除HA和NA以外的第3個(gè)外膜蛋白，M2的胞外區(qū)(M2ectodomain，M2e)是M2蛋白N端23個(gè)氨基酸，M2e在甲型流感病毒特別是人源的甲型流感病毒不同亞型間高度保守，M2尤其是M2e已成為廣譜流感疫苗研究中常用的靶抗原。目前，已有四種基于M2e的疫苗進(jìn)入I期臨床研究，這些疫苗的研究結(jié)果為早日研制成功防控流感大流行的廣譜流感疫苗提供了大量的實(shí)驗(yàn)資料。病毒樣顆粒(VLP)是由病毒的衣殼蛋白裝配成的不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，具有病毒的外形和免疫原性，可通過和病毒感染的途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以體液免疫為主的反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，由于VLP缺少遺傳物質(zhì)核酸，故避免了病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。VLP可以使外源表位以有序、陣列方式呈現(xiàn)，還能增加抗原的穩(wěn)定性和免疫原性，如大腸桿菌表達(dá)的HBc、番木瓜花葉病毒(PapMV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、噬菌體Q β等VLP已作為載體應(yīng)用于M2e-VLP疫苗研究。噬菌體V LP也是一種可將多肽抗原呈現(xiàn)在顆粒表面的載體。Q β-VLP可用作鼻腔免疫載體，有利于誘發(fā)局部和系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。目前國外已經(jīng)制備出Q β噬菌體VLP病毒樣顆粒用于降壓疫苗的IIa臨床實(shí)驗(yàn)。并已有M2e化學(xué)偶聯(lián)或者基因融合的VLP進(jìn)入臨床I期實(shí)驗(yàn)。目前已有4家公司報(bào)道了 I期的基于M2e的流感疫苗的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這四家公司分別 Acambis Inc.(英國)，Cytos BiotechnologyU^fi), Merck & CoInc.(美國)，and VaxInnate Corp.(美國)。有基于融合的M2e_HBcVLP和M2e_flagellin,也有化學(xué)偶聯(lián)的M2e-0MPC和M2e_AP205VLP。Q β噬菌體和ΑΡ205噬菌體都屬于RNA病毒，其外形成球形，由衣殼蛋白組成的病毒顆粒非常適合用作疫苗載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是構(gòu)建一種基于人甲型流感基質(zhì)蛋白M2的保守序列M2e的病毒樣顆粒偶聯(lián)物(M2e)n-Qi3-VLP通用流感疫苗，偶聯(lián)的方法可以為化學(xué)偶聯(lián)或者是基因融合。偶聯(lián)的M2e肽段可以串聯(lián)為M2e-M2e或者(M2e)n其中η為1、2、3、4、5、6、7、8。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:1.病毒樣顆粒的制備:本發(fā)明 利用了已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7)Q β噬菌體VLP作為偶聯(lián)用載體。這種突變的VLP具有以下特點(diǎn):(I)Qii噬菌體CP延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸序列AAGCTT (或者插入編碼M2e的單基因序列或者重復(fù)串聯(lián)的M2e基因序列)。并將CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆到原核表達(dá)載體上。(2)插入在第72位和73位氨基酸為賴氨酸和亮氨酸是Q β噬菌體衣殼蛋白刺突頂端，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的主要部門，即病毒樣顆粒的免疫優(yōu)勢決定區(qū)。(3)該VLP是由大腸桿菌可溶性表達(dá)的。制備噬菌體病毒樣顆粒Q β-VLP的具體步驟:菌種大腸桿菌DH5a/pETQ β-CP接種到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至適當(dāng)菌液達(dá)到OD值，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)后，收集菌液，使用超聲破碎細(xì)胞，裂解后，離心分別收集上清和沉淀。對形成的多聚體，使用SepharoseCL-4B層析柱純化。2.人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2保守序列M2e肽段的合成:采用固相合成法利用多肽合成儀自動(dòng)人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2的保守肽段M2e 的氨基酸序列為 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro He Arg Asn Glu Trp GlyCys Arg Cys Asn AspSer SerAsp Cys (GenBank:ACA49877.1),其中 M2e 的 C末端加入半月光氨酸Cys以便于Q β -VLP偶聯(lián)。偶聯(lián)的M2e肽段可以串聯(lián)為M2e_M2e或者(M2e)n其中η為 1、2、3、4、5、6、7、8。3.肽段M2e分別與噬菌體病毒樣顆粒Q β _VLP、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián):步驟:取50mg的Q β -VLP和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，并持續(xù)低速攪拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時(shí)后用于偶聯(lián)。取100mgM2e肽溶于5ml偶聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉緩沖液，0.1MEDTA,
0.9MNaCl，0.02% NaN3, ρΗ7.2)中，后將其與結(jié)合 Sulfo-SMCC 的 Q β -VLP 混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時(shí)后_80°C保存，此即為制備好的M2e-QP VLP。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物具有交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊的能力，為通用型流感疫苗的研制打下基礎(chǔ)。2.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒通過化學(xué)方法偶聯(lián)，制備時(shí)間短，且易于大規(guī)模生產(chǎn)，克服了傳統(tǒng)的用雞胚生產(chǎn)流感疫苗在研制、生產(chǎn)技術(shù)路線方面的不足。


圖1實(shí)施例二中小鼠抗血清滴度曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:實(shí)施例一、M2e-Q β -VLP綴合物和對照品M2e_鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)物的制備
步驟1、噬菌體病毒樣顆粒Q β -VLP的制備:將菌種大腸桿菌DH5 a /pETQ β -CP接種到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至適當(dāng)菌液達(dá)到OD值，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)數(shù)小時(shí)后，收集菌液，使用超聲破碎細(xì)胞，裂解后，離心分別收集上清和沉淀。對形成的多聚體，使用SepharoseCL-4B層析柱純化。步驟2、M2e多肽的合成:采用固相合成法利用多肽合成儀自動(dòng)合成人甲型流感病毒M2蛋白保守序列M2e步驟3、肽段M2e分別和噬菌體病毒樣顆粒Q β -VLP和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)。分別取50mg的Q β -VLP和KLH，和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，并持續(xù)低速攪拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時(shí)后用于偶聯(lián)。取100mgM2e肽溶于5ml偶聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉緩沖液，0.1MEDTA，0.9MNaCl,
0.02% NaN3,pH7.2)中，后將其分別與結(jié)合Sulfo-SMCC的Q β -VLP和KLH混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，PBS透析過夜，次日更換透析液，繼續(xù)透析4小時(shí)后_80°C保存，此即為制備好的M2e-Q β VLP和M2e_KLH。M2e_KLH為檢測M2e_Q β -VLP綴合物抗原性的對照品。實(shí)施例二、ELISA法檢測小鼠血清抗體滴度6周齡C57BL/6雌鼠，20只隨機(jī)分為4組，每組平均5只。組別分為M2e多肽組、M2e-Q0VLP組以及M2e-KLH組以及對照組。免疫方法、劑量、時(shí)間間隔、次數(shù)見下表I。表1:免疫策略
權(quán)利要求
1.甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，采用人甲型流感病毒基質(zhì)蛋白M2的胞外區(qū)M2e多肽作為半抗原，以已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7) Q β噬菌體病毒樣顆粒(Q β-VLP)作為載體，將I個(gè)M2e或多個(gè)M2e串聯(lián)體與Q β -VLP結(jié)合制備成綴合物(M2e)n-Q β -VLP, η為I至8的自然數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，所述的M2e多肽來自于人甲型流感病毒株基質(zhì)蛋白M2胞外區(qū)部分，所述的M2e多肽序列如SEQ N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，載體部分(Q β-VLP)采用的是已經(jīng)公開的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?201010028904.7)Qβ噬菌體病毒樣顆粒(QP-VLP)制備技術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e與病毒樣顆粒的綴合物，其特征在于，所述的綴合物能用于 保護(hù)不同亞型人甲型流感病毒的攻擊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫靶向治療的短肽載體Q β噬菌體病毒樣顆粒VLP與人流感病毒M2蛋白保守肽M2e的綴合物。所述綴合物主要用于預(yù)防人甲型流感。所述綴合物的偶聯(lián)方法采用Sulfo-SMCC方法。第一步制備Q β噬菌體的病毒樣顆粒VLP，第二步制備sulfo-SMMC活化的病毒樣顆粒VLP，第三步制備綴合物M2e-VLP。所述綴合物在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，并能交叉保護(hù)各亞型甲型流感病毒的攻擊。
文檔編號A61K39/145GK103083656SQ20111033089
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者姬云, 昇文國, 劉紅海, 許峰, 馬嚴(yán), 堵蕓倩 申請人:蘇州科貝生物技術(shù)有限公司