本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物有效成分分離純化領(lǐng)域，具體涉及到一種脫氧野尻霉素的提取方法。
背景技術(shù)：
：脫氧野尻霉素(deoxynojirimycin，dnj)是一種存在于桑樹及其他植物和微生物中的多羥基哌啶生物堿，化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為c6h13no4，分子量為163，具有與α-1,4-葡萄糖類似的結(jié)構(gòu)，是強(qiáng)效的α－葡糖苷酶抑制劑，具有降血糖功能，此外還具有抗腫瘤及抗病毒活性。天然脫氧野尻霉素目前已成為國(guó)際公認(rèn)的用于糖尿病臨床治療的生物制劑原料，藥用價(jià)值高，應(yīng)用前景可觀。然而，對(duì)脫氧野尻霉素進(jìn)行分離純化存在諸多困難，現(xiàn)有的大多數(shù)分離純化技術(shù)由于操作復(fù)雜或工藝條件苛刻以致其效率較低，限制了脫氧野尻霉素的開發(fā)利用，難以滿足醫(yī)藥與保健品市場(chǎng)的需要。尤其是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)天然脫氧野尻霉素的過程中需要去除植物提取液中常見的蛋白質(zhì)、淀粉、色素、粘液質(zhì)、果膠、樹膠等雜質(zhì)，這也是目前天然dnj研究與開發(fā)中的技術(shù)難點(diǎn)。目前報(bào)道中，結(jié)晶、酸提、正丁醇萃取、離子交換樹脂、大孔吸附樹脂、硅膠層析、反相層析、凝膠過濾層析、膜分離等技術(shù)都被用于純化脫氧野尻霉素。cn103965096a公開了一種適用于工業(yè)生產(chǎn)的1-脫氧野尻霉素的制備方法，包括以下步驟：(1)原料前處理：將干燥原料桑葉粉碎；(2)酶解：向粉料中加入水，升溫，加入組合酶酶解，過濾；(3)連續(xù)組合提取：將濾渣使用3-4個(gè)提取裝置連續(xù)組合提取，合并提取液，過濾；(4)醇沉、離心：減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，冷卻，調(diào)節(jié)ph，加入醇溶液，攪拌，靜置，管式離心；(5)膜濾：在常溫壓力25-35bar條件下，使用有機(jī)超濾膜進(jìn)行超濾處理，然后在常溫壓力0.5-1.5mpa條件下，使用納濾膜進(jìn)行納濾處理；(6)濃縮；(7)干燥。利用本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)很大程度地降低溶劑損耗量、降低能耗、提高產(chǎn)品收率，適用于工業(yè)生產(chǎn)。cn103755623a公開了一種響應(yīng)面法優(yōu)化的酸性乙醇溶液提取桑葉中1-脫氧野尻霉素(1-dnj)的方法，本發(fā)明方法用酸性乙醇溶液作為提取溶媒提取桑葉1-dnj，利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為液料比為25，即25ml提取溶媒/g桑葉粗粉，在80℃條件下浸提2.7h，重提1次，濾液經(jīng)純化、濃縮后得1-dnj提取液；本發(fā)明方法可獲得約0.2％的桑葉1-dnj提取率，顯著高于傳統(tǒng)的乙醇提取率0.00139％，及稀酸提取效率0.00147％，說明稀酸和乙醇在浸提桑葉1-dnj中發(fā)生了協(xié)同作用，產(chǎn)生了不可預(yù)見的效果，為桑葉1-dnj產(chǎn)品的在醫(yī)藥和保健品方面的開發(fā)利用提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。cn103936664a公開了一種桑樹成分的提取方法，尤其涉及桑樹中脫氧野尻霉素的提取純化方法。它包括以下步驟：水提：取桑樹葉片曬干，然后加去離子水，恒溫沸騰提取，過濾收集濾液，濾渣加去離子水再提取，合并濾液，加入三氯乙酸離心，得第一上清液；上柱：將所述第一上清液用反向柱色譜進(jìn)行純化，得到含有脫氧野尻霉素的液體；醇沉取上清：在上柱后所得的含有脫氧野尻霉素的液體中先加入含醇質(zhì)量55-65％的乙醇攪拌3-8min，然后再加入含醇質(zhì)量70-80％乙醇攪拌3-5min，得第二上清液；濃縮：將所述第二上清液濃縮后得濃縮液；微波真空干燥：將所述濃縮液微波真空干燥得到含有脫氧野尻霉素的粉末產(chǎn)品。本發(fā)明提取純化提取率高、分離效果好。但是上述方法或純度不高，或使用難處理的有機(jī)溶劑，或步驟繁多，不適于工業(yè)生產(chǎn)，因此，現(xiàn)有的脫氧野尻霉素提取方法無法提供高純度脫氧野尻霉素并適合工業(yè)生產(chǎn)，本發(fā)明旨在公開一種脫氧野尻霉素的提取方法，促進(jìn)脫氧野尻霉素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法提取得到的脫氧野尻霉素純度高，所述方法綠色環(huán)保，易于放大，工藝簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將桑樹原料與水混合，超聲處理，固液分離，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液進(jìn)行親和層析，使用脫附液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行濃縮，對(duì)濃縮液進(jìn)行干燥，得到脫氧野尻霉素。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，使用親和層析具有高選擇性，簡(jiǎn)化了制備工藝，得到的脫氧野尻霉素純度更高，收率更高。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(1)所述桑樹原料包括桑樹的樹葉、樹枝、樹皮或樹根中任意一種或至少兩種的組合，所述組合典型但非限制性實(shí)例有：樹葉和樹枝的組合、樹枝和樹皮的組合、樹皮和樹根的組合、樹根和樹葉的組合或樹葉、樹皮、樹枝和樹根的組合等。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(1)所述混合前對(duì)桑樹原料進(jìn)行粉碎。優(yōu)選地，步驟(1)所述水與桑樹原料的質(zhì)量比為(5～50):1，如5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等，但并不僅限于所列舉的數(shù)值，該數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述超聲處理的溫度為50～80℃，如50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃等，但并不僅限于所列舉的數(shù)值，該數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。優(yōu)選地，步驟(1)所述超聲處理的時(shí)間為30～60min，如30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等，但并不僅限于所列舉的數(shù)值，該數(shù)值范圍內(nèi)其他未列舉的數(shù)值同樣適用。優(yōu)選地，步驟(1)所述超聲處理的次數(shù)為3～5次，如3次、4次或5次等。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(1)所述固液分離的方法包括過濾、離心、沉降或蒸發(fā)中任意一種或至少兩種的組合，所述組合典型但非限制性實(shí)例有：過濾和離心的組合、離心和沉降的組合、沉降和蒸發(fā)的組合或沉降、蒸發(fā)和過濾的組合等。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(2)所述親和層析的配基為葡萄糖苷酶。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(2)所述脫附液包括乙醇。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(3)所述對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮的方法為減壓蒸餾。優(yōu)選地，步驟(3)所述濃縮過程中對(duì)脫附液進(jìn)行回收。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(3)所述干燥的方法包括加熱干燥、鼓風(fēng)干燥、自然干燥或冷凍干燥中任意一種或至少兩種的組合，所述組合典型但非限制性實(shí)例有：加熱干燥和鼓風(fēng)干燥的組合、鼓風(fēng)干燥和自然干燥的組合、自然干燥和冷凍干燥的組合、冷凍干燥和加熱干燥的組合或加熱干燥、鼓風(fēng)干燥和自然干燥的組合等，優(yōu)選為冷凍干燥。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述方法包括以下步驟：(1)將桑樹原料與5～50倍質(zhì)量的水混合，50～80℃下超聲處理30～60min，并反復(fù)超聲處理3～5次，固液分離，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液進(jìn)行親和層析，使用脫附液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收脫附液，對(duì)濃縮液進(jìn)行干燥，得到脫氧野尻霉素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法提取得到的脫氧野尻霉素提取率可到90％以上，最高可達(dá)94.7％，純度高于99％，最高可達(dá)99.6％；(2)本發(fā)明提供一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法綠色環(huán)保，易于放大，工藝簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施方式為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。實(shí)施例1一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹葉粉碎與5倍質(zhì)量的水混合，50℃下超聲處理3次共60min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧野尻霉素。實(shí)施例2一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹枝粉碎與50倍質(zhì)量的水混合，80℃下超聲處理5次共30min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧野尻霉素。實(shí)施例3一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹皮粉碎與50倍質(zhì)量的水混合，80℃下超聲處理5次共60min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧野尻霉素。實(shí)施例4一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹葉粉碎與50倍質(zhì)量的水混合，50℃下超聲處理3次共30min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧野尻霉素。實(shí)施例5一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹根粉碎與25倍質(zhì)量的水混合，60℃下超聲處理4次共40min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行加熱干燥，得到脫氧野尻霉素。實(shí)施例6一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法包括以下步驟：(1)將1kg桑樹樹葉粉碎與40倍質(zhì)量的水混合，70℃下超聲處理3次共45min，過濾，收集清液；(2)對(duì)步驟(1)得到的清液使用葡萄糖苷酶親和層析柱進(jìn)行親和層析，使用乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(3)對(duì)步驟(2)得到的洗脫液進(jìn)行減壓蒸留濃縮，回收乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧野尻霉素。對(duì)比例1采用cn103965096a中實(shí)施例1的方法，對(duì)1kg桑樹樹葉中的脫氧野尻霉素進(jìn)行提取，所述方法包括以下步驟：(1)原料前處理：將1kg桑樹樹葉粉碎，過24目篩，得粉料99.5kg；(2)酶解：向步驟(1)所得的粉料中加入600kg水，升溫至50℃，然后加入200g的組合酶(纖維素:果膠酶＝4:1，w/w)，保持溫度酶解5h，過濾，得濾渣；(3)連續(xù)組合提?。簩⒉襟E(2)所得的濾渣均分4份，分別置于4套提取裝置中進(jìn)行連續(xù)組合提取，對(duì)每個(gè)提取裝置中的濾渣提取4次，每次提取溶劑為干燥原料重量9倍的體積分?jǐn)?shù)80％的乙醇(含體積分?jǐn)?shù)為0.4％的鹽酸，鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.5％)，提取溫度為85℃，提取時(shí)間為2.2h，提取后，合并提取液，過濾；(4)醇沉、離心：將經(jīng)步驟(3)過濾后的提取液進(jìn)行減壓濃縮，減壓濃縮的溫度為65℃，真空度為-0.06mpa，濃縮至原體積的1/3，得595kg濃縮液，向濃縮液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)ph為8.5，然后加入1800kg體積分?jǐn)?shù)80％的乙醇溶液，攪拌15min后，靜置4h，管式離心，速率為14000r/min，得離心液；(5)膜濾：將步驟(4)所得的離心液過聚碳酸酯超濾膜，壓力為25-35bar，孔徑為10kda，得超濾液，然后使用聚酰胺復(fù)合膜進(jìn)行納濾處理，壓力為0.5-1.0mpa，孔徑為600～800da，得納濾液；(6)濃縮：將步驟(5)所得的納濾液進(jìn)行減壓濃縮，減壓濃縮的溫度為70℃，真空度為-0.08mpa，濃縮至原體積的1/6，得濃縮液297kg；(7)干燥：將所得的濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得成品。對(duì)比例2采用cn103936664a實(shí)施例1所述方法對(duì)1kg桑樹樹葉中的脫氧野尻霉素進(jìn)行提取。對(duì)比例3一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法除了步驟(2)采用反相層析替代親和層析外，其他條件均與實(shí)施例1相同。對(duì)比例4一種脫氧野尻霉素的提取方法，所述方法除了步驟(2)采用凝膠過濾層析替代親和層析外，其他條件均與實(shí)施例1相同。實(shí)施例1-6以及對(duì)比例1-4提取的脫氧野尻霉素的提取率和純度如表1所示。表1項(xiàng)目提取率純度實(shí)施例194.7％99.4％實(shí)施例291.3％99.5％實(shí)施例394.2％99.6％實(shí)施例493.3％99.5％實(shí)施例592.1％99.5％實(shí)施例694.6％99.3％對(duì)比例189.7％13.7％對(duì)比例256.8％98.3％對(duì)比例378.4％89.7％對(duì)比例466.9％54.6％通過表1看出，實(shí)施例1-6的提取率均在90％以上，最高可達(dá)94.7％，而純度均大于99％，最高可達(dá)99.6％。對(duì)比例1采用現(xiàn)有技術(shù)中的一種野尻霉素提取方法，提取率為89.7％，純度僅為13.7％，遠(yuǎn)低于本發(fā)明的提取率。對(duì)比例2采用現(xiàn)有技術(shù)中另一種野尻霉素的提取方法，其純度可達(dá)98.3％，而提取率僅為56.8％，低于本發(fā)明90％以上的提取率。對(duì)比例3和對(duì)比例4分別采用反相層析以及凝膠過濾層析替代本發(fā)明采用的親和層析的方法，野尻霉素的提取率和純度均有不同程度的下降。申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12