專利名稱：防治香蕉枯萎病的海洋細菌2bs12的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋生防菌株2BS12，屬于作物防病治病技術(shù)領(lǐng)域， 專用于香蕉枯萎病的無公害防治。背景技術(shù)：
香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、香蕉黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴?；?/^sari oxysporum f. sp. /知引起的維管束萎蔫病害。病原菌從寄主根部的傷口入侵，通過維管束經(jīng)球莖、假莖向上部葉片蔓延，病原菌堵塞木質(zhì)部導管，給植株的水分運輸帶來障礙，導致植株枯萎死亡。這種毀滅性的土傳病害，一旦一個地塊發(fā)病，病菌很快蔓延開來，很難根治，因而被稱為“香蕉癌癥”。因此對香蕉枯萎病進行防治迫在眉睫。目前對該病還尚無有效的防治方法，沒有理想的化學藥劑和優(yōu)質(zhì)的抗病品種問世。一些栽培管理措施也只能起到局部的控制作用。并且長期使用一些化學殺菌劑、改良劑，極易導致病原菌抗藥性問題突出，且破壞土壤的生態(tài)環(huán)境，對人類不安全。而微生物源農(nóng)藥可以利用微生物產(chǎn)生抗病物質(zhì)，與病原菌競爭營養(yǎng)、空間位點，誘導植物產(chǎn)生抗病性等方式，安全、有效地防治植物病害，在植物病害的防治中具有重要的應(yīng)用價值。綜上所述，這種環(huán)境友好型的高效、安全的微生物殺菌劑在香蕉枯萎病的防治中具有廣闊的發(fā)展空間，同時也是農(nóng)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要。現(xiàn)有技術(shù)中按照本實驗室的菌體保藏液專利(公開專利號CN1358838，
公開日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2-3年。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是針對目前尚無對香蕉枯萎病具有較好防治效果的生防制劑的現(xiàn)狀， 提供開發(fā)一種防治香蕉枯萎病的生防菌株，該菌為海洋細菌，從海洋植物秋茄GfmWia candel (L.) Druce)根圍分離獲得。對香蕉枯萎病具有較好的防治效果，并具有促進植物生長的功能。技術(shù)方案
一種防治香蕉枯萎病的海洋細菌2BS12，為解淀粉芽孢桿柳― _yl0liquefaCienS\2Q\Q年込只3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為 CGMCC NO. 4045。2BS12在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)10小時后產(chǎn)生單菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣有細齒，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生芽孢?？煞置诘鞍酌?、纖維素酶及嗜鐵素。生防菌株2BS12制備生防菌劑的方法為
將上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20- 小時，然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液(專利號ZL02112559. 7，公開專利號CN1358838，
公開日2002年7月17日)，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑，菌劑成品種活菌總濃度為IX IO9-I X IO12 CFU/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30分鐘，接著用四層紗布過濾，濾液加20克蔗糖，定容至 1000 ml，調(diào)節(jié)PH至7. 2-7. 4，121°C滅菌20分鐘。菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液， 還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對香蕉枯萎病開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，對環(huán)境友好，完全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，對人無害， 有利于無公害生產(chǎn)、有機生產(chǎn)。同時，該菌劑還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。離體試驗表明，2BS12菌劑對香蕉枯萎病病原菌的生長有很好的抑制作用(圖1)。 溫室實驗表明該菌制劑能顯著降低由香蕉枯萎病1號、4號生理小種引起的病害的發(fā)生， 并兼有促進香蕉生長的作用(表1，2)。田間試驗表明使用該菌劑對香蕉枯萎病的防治效果可達35%以上，顯著優(yōu)于化學農(nóng)藥多菌靈(表3)。該菌劑用濕菌與本實驗室的菌體保藏液(屬本實驗室已授權(quán)專利，專利號 ZL02112559. 7，公開專利號CN1358838，
公開日:2002年7月17日)按1 :40 (g/ml)配成菌劑，可室溫保存2-3年。該菌劑可以在移栽時灌根使用，也可以在移栽前倒入有機肥中制成堆肥，然后隨肥料在整地過程中埋到土里。四


圖1 2BS12菌劑對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種的生長抑制情況圖2溫室試驗中2BS12菌劑處理35天后對香蕉枯萎病的防治效果(巴西蕉) 圖3溫室試驗中2BS12菌劑處理50天后對香蕉苗的促生效果(巴西蕉) 五具體實施方式
1. 2BS12生防菌劑的制備
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋細菌2BS12，為解淀粉芽孢桿菌OfeciBm amyloliquefaciens)，hk侮灃堪嫩HQKandelia candel (L.) Druce)根圍分離得到。 2BS12在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)10小時后產(chǎn)生單菌落，菌落為乳白色，圓形，邊緣有細齒，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生芽孢?？煞置诘鞍酌浮⒗w維素酶及嗜鐵素。將上述防治香蕉枯萎病的菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20_24 小時，然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑，菌劑成品種活菌總濃度為IX IO9-I X IO12 CFU/ml。所用PDA培養(yǎng)液配制方法為用 200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30分鐘，接著用四層紗布過濾，濾液加20 克蔗糖，定容至1000 ml，調(diào)節(jié)PH至7. 2-7.4，121°C滅菌20分鐘。菌體保藏液為0. Olmol/ L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. OOlmol/L的Tween20非離子型表面活性劑。. 2BS12菌劑對香蕉枯萎病病原菌的生長抑制試驗
將1 ml濃度為IO8 CFU/ml的2BS12菌劑加入200 ml PDA培養(yǎng)基中，混勻，倒平板，以不加2BS12菌劑的PDA培養(yǎng)基作對照，在每個平板的中心接上一個直徑為5 mm的香蕉枯萎病病原菌菌塊，在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，測定病原菌的生長情況。圖1為2BS12菌劑對香蕉枯萎病病菌的抑制作用。表1 2BS12菌劑施用K天后對香蕉枯. 2BS12菌劑的溫室防效試驗
病原菌孢子懸浮液的制備香蕉枯萎病病原菌1號生理小種(Foc-Rl)、4號生理小禾中(Foc_R4) (R. Morpurgo et al. , 1994, Selection parameters for resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4 on diploid banana Qfusa acuminate Colla))，分別用PDA培養(yǎng)液在25° C，150 rpm/min條件下培養(yǎng)7_10天，用無菌紗布濾去菌絲得孢子懸浮液。用血球計數(shù)板測定孢子懸浮液的濃度，并將孢子懸浮液濃度調(diào)至IO7個孢子/ml，備用。選用4-5葉期的香蕉苗，生防菌處理組，每株苗用30 ml濃度為IO8 CFU/ml的 2BS12菌液灌根處理，對照組用清水處理，每個處理6棵苗，每處理重復3次。待生防菌處理 5天后，每株苗澆30 ml病原菌孢子懸浮液?！皬V粉1號”澆灌R)c_Rl，“巴西蕉”和“農(nóng)科1 號”澆灌R)c_R4。待蕉苗開始發(fā)病后，觀察記錄葉片黃化狀況，病原菌處理45天后統(tǒng)計最終結(jié)果。按Ploetz (Ploetz, 1999)的病情統(tǒng)計分級，根據(jù)植株黃化、萎蔫狀況進行病情統(tǒng)計
O級一植株健康；
1級--輕度褪綠和萎蔫，葉柄不下垂； 2級一中度褪綠、萎蔫，少數(shù)葉柄下垂和(或)莖基部開裂； 3級一嚴重褪綠、萎蔫，葉柄下垂，植株矮化； 4級一死亡。病害嚴重度(％)= [ Σ (病級數(shù)X該病級植株數(shù))/(最高病級X總植株數(shù))]X 100% 生防效果(％)=[(對照1病害嚴重度-處理組病害嚴重度)/對照1病害嚴重度]X100% 溫室防效試驗結(jié)果表明(表1，圖2)，2BS12菌劑處理組能夠很好的抑制香蕉枯萎病的
發(fā)生，其防治效果達到52. 37-77. 78%。
權(quán)利要求
1.一種防治香蕉枯萎病的海洋細菌2BS12，為解淀粉芽孢桿 _yl0liquefaCienS\2Q\Q年込只3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 4045。
2.用權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治香蕉枯萎病方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12用于制備生防菌劑的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述生防菌株2BS12在PDA培養(yǎng)液30°C 180 rpm振蕩培養(yǎng)20- 小時， 然后6000 rpm離心10分鐘，取2BS12濕菌與菌體保藏液，按質(zhì)量體積比為1 :40配成菌劑， 菌劑成品種活菌總濃度為1 X IO9-I X IO12 CFU/ml，菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液， 還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌株2BS12用于制備生防菌劑的方法，其特征在于，所用 PDA培養(yǎng)液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后至少煮20分鐘以上，接著用四層醫(yī)用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調(diào)至7. 2-7. 4，然后121°C滅菌 20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的海洋細菌2BS12，屬于植物保護技術(shù)領(lǐng)域。該菌是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，將該菌在PDA培養(yǎng)液37℃180rpm振蕩培養(yǎng)20-24小時，然后6000rpm離心10分鐘，取濕菌與本實驗室的菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109-1×1012CFU/ml。在不同香蕉品種上，對香蕉枯萎病的溫室防效為52.37-77.78%，促生效果為17.08-51.19%，田間防效達到35.96%。該菌劑可以噴霧使用，做成堆肥使用，也可稀釋后在移栽時灌根使用。
文檔編號A01N63/02GK102172249SQ201110071160
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者鄭穎, 郭堅華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學