生物制劑及在制備預(yù)防和控制埃博拉病毒的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中新型抗病毒生物制劑，具體為一種預(yù)防和控制埃 博拉病毒感染的生物制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒病（Ebolavirus disease，EVD)是由埃博拉病毒（Ebolavirus，ElBOV) 感染引起的經(jīng)體液或密切接觸傳播的病毒性傳染病。埃博拉病毒在自然界的保存宿主是果 蝠，主要對包括人類在內(nèi)的靈長類致病，自上世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒以來，該病毒感 染已經(jīng)零星在中非地區(qū)有過局部爆發(fā)，但從2014年蔓延到今年的西非埃博拉疫情遠(yuǎn)超歷 史上任何一次爆發(fā)，據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計，截至2015年4月8日，總感染人數(shù)為25550人，其中超 過10587人死亡。該病的潛伏期為2至21天，早期癥狀為發(fā)熱、胃腸道不適、肌肉疼痛等， 隨著病情的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)內(nèi)外出血、極度虛弱等癥狀，最后發(fā)展為肝腎等臟器衰竭。
[0003] 埃博拉病毒屬于絲狀病毒科（Filoviridae)，目前發(fā)現(xiàn)的埃博拉病毒有五 種型，分別是 Zaire ebolavirus(ZEBOV)，Sudan ebolavirus (SEBOV)，Bundibugyo ebolavirus(BEBOV)，Tai Forest ebolavirus (TFEBOV)和 Reston ebolavirus(REBOV)。其 中Zaire和Sudan型埃博拉病毒的致病性最高，并且是歷史上造成埃博拉流行的主要病毒 型，本次疫情中流行的埃博拉病毒也屬于Zaire型。埃博拉病毒在自然界中有特定的保存 宿主和完整的感染循環(huán)，所以不能像天花病毒一樣通過在人群中預(yù)防接種疫苗而被滅絕， 非洲獨特的自然環(huán)境、風(fēng)俗習(xí)慣和相對落后的公共衛(wèi)生體系是造成埃博拉在非洲爆發(fā)的重 要因素，每次埃博拉疫情基本都源于人類與攜帶病毒的野生動物的接觸。由于人類與野生 動物接觸而感染病毒屬于隨機事件，無法預(yù)測下一次疫情出現(xiàn)的時間和地點，而全球一體 化的進程使得每次疫情都可能向全球蔓延，例如本次疫情已經(jīng)波及歐洲和美洲。
[0004] 目前防控埃博拉疫情主要依靠診斷和隔離，對病人采取對癥支持治療。針對該病 的特效藥物和疫苗都處于臨床前或臨床試驗階段。一些抗埃博拉藥物在先期臨床試驗中已 經(jīng)顯示出比較好的療效，其中最著名的是抗體類藥物ZMapp，但ZMapp用于治療存在以下兩 個問題。首先，ZMapp由三種針對Zaire型埃博拉病毒的中和抗體組成，能否在未來可能爆 發(fā)的疫情中針對變異后的抗原或是其他型別的埃博拉病毒產(chǎn)生有效保護，還未能證實；其 次，ZMapp的生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，成本較高，且需要較完備的儲存、運輸條件，因此如何在非 洲經(jīng)濟相對落后的國家用于疫情控制也是一個難題。
[0005] 因此，研發(fā)一種安全、有效（同時針對不同型別的埃博拉病毒)、廉價(在非洲及廣 大欠發(fā)達(dá)地區(qū)能廣泛使用)，易于長期儲存(可作為戰(zhàn)略儲備藥物）的藥物對于控制未來可 能出現(xiàn)的埃博拉疫情十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對抗埃博拉病毒藥物的缺乏和不足狀況，提供一種新型的預(yù)防 和控制多種基因型埃博拉病毒感染的生物藥物制劑。通過設(shè)計蛋白質(zhì)多肽類的病毒進入抑 制劑，阻斷埃博拉病毒進入其靶細(xì)胞，使人體細(xì)胞免于病毒感染，從而起到預(yù)防和控制病毒 感染的目的。使用活性酸酐來修飾和封閉經(jīng)純化的蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸，從而使 修飾后的蛋白具有阻斷多種基因型的埃博拉病毒進入和感染靶細(xì)胞的活性，成為抗埃博拉 候選藥物。
[0007] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種預(yù)防和控制多種基因型埃博拉病毒感染的生物制劑，采用以下步驟制備： (1) 、將3-羥基-鄰苯二甲酸酐用二甲基亞砜配制成濃度為IM的母液； (2) 、配制濃度為0. lM、pH為8. 5的磷酸氫二鈉溶液，人血清白蛋白加入磷酸氫二鈉溶 液制成HSA溶液，HSA溶液濃度為20mg/ml; (3) 、將母液加入待修飾的HSA溶液中，使加入的酸酐終濃度為12mM，充分混勻后，用 NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至9. 0, 25°C孵育20min; (4) 、重復(fù)進行步驟（3)所述的母液與HSA溶液混合過程，最終使HSA溶液中酸酐的終 濃度為60mM，調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至9.0，25°C孵育2h，完成酸酐化反應(yīng)； (5) 、將酸酐化蛋白溶液裝入截留量為7. 5KDa的透析袋中，置于pH7. 4的磷酸鹽緩沖液 中透析換液，4°C下透析48h，將酸酐化蛋白溶液用0. 45 ym微孔濾膜過濾，于4°C保存，即可 按照常規(guī)方法制成各種劑型的成品。
[0008] 所述3_羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)可以用馬來酸酐（maleic anhydride，縮寫為 ML)或者琥I自酸酐（succinic anhydride，縮寫為SU)代替。
[0009] 所述人血清白蛋白（HSA)可以用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，縮寫為 BSA)、牛(6-乳球蛋白（0-lactoglobulin，縮寫為0-LG)、鼠血清白蛋白（mouse serum albumin，縮寫為 MSA)、卵清蛋白（ovalbumin，縮寫為 OVA)、RNA 酶 I (RNaseI)或者 RNA 酶 7 (RNase7)代替。
[0010] 上述生物制劑具有在制備預(yù)防和控制Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的藥物中的 應(yīng)用。
[0011] -、酸酐修飾蛋白濃度測定 將上述制備得到的酸酐化蛋白樣品按照BCA蛋白濃度分析試劑盒的操作步驟測定濃 度，具體方法如下： (1) 使用PBS溶液稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA)，使BSA終濃度為0、0. 1、0. 2、0. 4、l、2mg/mL ; (2) 分別將20 y 1各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和20 y 1待測樣品（使用PBS進行稀釋）加入96孔板 中； (3) 制備BCA工作液，將A液與B液按1 :50比例混勻； (4) 每孔加入200 y 1工作液，輕柔混勻，37°C孵育20min ; (5) 待冷卻至室溫后，使用酶標(biāo)儀在562nm處讀取各空吸光度； (6) 根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品OD讀數(shù)，使用Excel和SigmaPlot軟件繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如 圖5所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及對應(yīng)公式計算酸酐化蛋白樣品濃度。
[0012] 二、埃博拉假病毒的制備 (1)分別對 2014 年 Zaire 型埃博拉病毒株（GenBank :KM034549. 1)和 2012 年 Sudan 型埃博拉病毒株（Genebank :KC545389. 1)的包膜蛋白（GP蛋白）基因序列進行密碼子優(yōu)化， 并進行基因合成。Zaire型GP蛋白基因合成序列記為"合成基因1"（堿基序列見序列表)， Sudan型GP蛋白基因合成序列記為"合成基因2"（堿基序列見序列表)。
[0013] (2)運用分子克隆的方法將合成基因1與合成基因2分別裝載于pcDNA3. 1 (Invitrogen)表達(dá)載體的多克隆位點上，重組質(zhì)粒分別命名為pcDNA3.I-Zaire-GP和 pcDNA3.I-Sudan-GP ;將鑒定正確的重組質(zhì)粒保存于ToplO大腸桿菌菌株中。
[0014] (3)使用終濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)人胚腎 細(xì)胞HEK293T。當(dāng)細(xì)胞生長接合度約為70%時，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，37 °C繼續(xù)培 養(yǎng)lh。將210y 1的PEI轉(zhuǎn)染試劑（I y g/y 1)與3y g的pcDNA3. I-Zaire-GP質(zhì)粒以及 65 y g的pNL4-3 Luc. R-E-質(zhì)?；旌虾?，與T75培養(yǎng)瓶中的HEK293T細(xì)胞于37°C孵育6h。 更換DMEM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)60h后收集培養(yǎng)基上清液，上清液用0. 45 y m微孔濾膜過濾， 分裝后于_80°C保存。該上清液中包含Zaire型埃博拉病毒假病毒，同理，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒換為 pcDNA3. I-Sudan-GP與pNL4_3 Luc. R-E-質(zhì)粒的混合物，可以制備得到Sudan型埃博拉病毒 假病毒。
[0015] 埃博拉假病毒由展示埃博拉病毒包膜蛋白的病毒包膜和攜帶螢光素酶 (Luciferase)報告基因的缺陷型慢病毒核衣殼構(gòu)成，其中慢病毒衣殼與報告基因核酸由 PNL4-3Luc.R- E-質(zhì)粒合成。埃博拉假病毒可以單次感染埃博拉病毒易感細(xì)胞，模擬埃博 拉病毒與細(xì)胞受體結(jié)合、內(nèi)吞以及膜融合過程。
[0016] 三、利用埃博拉假病毒研究酸酐化蛋白對埃博拉病毒的進入抑制作用（抗病毒活 性） 使用終濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系Huh7。 將Huh7細(xì)胞使用胰酶消化處理后鋪于96孔板，待細(xì)胞生長密度接近80%時，取濃度10 y M 的HP酸酐修飾的HSA酸酐化蛋白（HP-HSA)溶液，使用DMEM培養(yǎng)基進行2倍梯度稀釋，分別 將50 y 1各濃度梯度的HP-HSA稀釋液與50 y 1的Zaire型埃博拉假病毒溶液混合（HP-HSA 終濃度為5 y M)，室溫孵育0. 5h。將100 y 1上述各梯度混合溶液分別加入96孔板單個孔 中，每個藥物濃度設(shè)三個復(fù)孔。使用相同濃度梯度稀釋的未修飾的HSA溶液作為藥物陰性 對照組，同樣與假病毒混合；同時設(shè)定只加入假病毒而沒有加入HP-HSA的感染陽性對照組 和既不加HP-HSA也無假病毒的感染陰性對照組。37°C培養(yǎng)細(xì)胞至感染后12h，換新鮮培養(yǎng) 基；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至感染后72h，使用PBS溶液清洗細(xì)胞一次，每孔加入20 y 1細(xì)胞裂解液， 室溫