裂解細(xì)胞lh，每孔取10 y 1細(xì)胞裂解混合物，加入50 y 1熒光素酶反應(yīng)底物溶液，使用 熒光讀數(shù)器讀取各孔熒光值。使用以下計(jì)算公式計(jì)算各濃度梯度藥物對假病毒的進(jìn)入抑制 率： 病毒進(jìn)入抑制率（％)=[(感染陽性對照組熒光讀數(shù)均值-實(shí)驗(yàn)組各孔熒光讀數(shù)）八感 染陽性對照組熒光讀數(shù)均值-感染陰性對照組熒光讀數(shù)均值）]*100。
[0017] 根據(jù)各濃度病毒進(jìn)入抑制率，使用SigmaPlot軟件做出抑制率與藥物濃度的曲線 關(guān)系圖（如圖1所示）；使用CalcuSyn軟件計(jì)算HP-HSA抑制Zaire型假病毒進(jìn)入的半數(shù)抑 制濃度（IC50值)。
[0018] 同理，可以用相同的方法得到ML-HSA、SU-HSA與Zaire型假病毒的抑制率與藥物 濃度的曲線關(guān)系圖，以及對應(yīng)的IC50值(如圖2所示）;用相同的方法得到HP-HSA、ML-HSA、 SU-HSA與Sudan型假病毒的抑制率與藥物濃度的曲線關(guān)系圖，以及對應(yīng)的IC50值(如圖3 所示)。
[0019] 按照相同的方法，測定包括HP-P-LG、ML-P-LG、SU-P-LG、HP-OVA、HP-BSA、 HP-RNasel、HP-MSA等多種酸酐化蛋白的病毒抑制曲線和IC50值，如表I所示。
[0020] 表 1
四、酸酐化蛋白的細(xì)胞毒性研究 HP-HSA的細(xì)胞毒性檢測，方法如下： (1) 將Huh7細(xì)胞以4X IO3個(gè)/孔的比例均勻的鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C培養(yǎng)過 夜； (2) 將待測HP-HSA樣品和未經(jīng)修飾的HSA分別用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，HP-HSA 和HSA樣品的起始濃度均為100 y M ; (3) 將上述過夜培養(yǎng)的Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出，并將稀釋好的樣品以100W /孔的體 積加入Huh7細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置含有1%TritonX100的細(xì)胞毒性對照組和只加入DMEM培養(yǎng) 基的細(xì)胞對照組，每種每個(gè)稀釋度做5個(gè)復(fù)孔，37°C繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h ; (4) 吸出各孔的培養(yǎng)液，每孔加入IOOW含有3W CCK8試劑的DMEM培養(yǎng)液，37°C繼續(xù) 孵育3h ; (5) 使用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度值（OD)，使用以下公式計(jì)算各孔細(xì)胞存活率： 活性細(xì)胞比率（％)=[(0D 450nm樣品-OD 450nm細(xì)胞毒性對照組均值V(0D 450nm細(xì) 胞對照組均值-OD 450nm細(xì)胞毒性對照組均值）]* 100。
[0021] 使用SigmaPlot軟件制作細(xì)胞存活率柱狀圖（如圖6所示)，該圖體現(xiàn)HP-HSA作為 生物藥物制劑的細(xì)胞毒性與劑量間的關(guān)系。
[0022] 五、檢測酸酐化蛋白氨基酸修飾率與病毒抑制活性的關(guān)系 (1)分別用HP最終濃度為2. 5、5、12、25、36、48、60mM的體系制備HP酸酐化的HSA蛋 白； (2)將以上酸酐化HSA樣品和未經(jīng)酸酐化修飾的HSA (陰性對照組）用0.1 M的磷酸氫 二鈉溶液（PH8. 5)稀釋至lmg/ml濃度，以25 y 1/孔的體積加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置每孔加 入25 y 1的0.1 M的磷酸氫二鈉溶液（pH8. 5)的空白對照組，以上各組樣品均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔； 每孔加入25 y 1濃度為0.1 M的四硼酸鈉，混合均勻，室溫放置5min ;每孔加入10 y 1的2， 4,6-三硝基苯橫酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，縮寫為 TNBS)，混合均勾，室 溫放置5min;每孔加入IOOyl的反應(yīng)終止液（0.1 M的磷酸氫二鈉溶液，1.5mM的亞硫酸 鈉，pH8. 5);使用酶標(biāo)儀在420nm處檢測各孔的OD值，根據(jù)下列公式計(jì)算HSA表面賴氨酸的 酸酐化修飾率： 賴氨酸修飾率（％)= [I- (0D 420 nm樣品-OD 420nm空白對照組均值）/ (0D 420nm 陰性對照組均值-OD 420nm空白對照組均值）]* 100。
[0023] 使用SigmaPlot軟件制作酸酐化修飾體系中HP的終濃度與HSA表面賴氨酸的酸 酐化修飾率的對應(yīng)關(guān)系圖(如圖7所示)。
[0024] (3)同樣將以上酸酐化HSA樣品和未經(jīng)酸酐化修飾的HSA (陰性對照組）用0.IM 的磷酸氫二鈉溶液（pf!9. 0)稀釋至lmg/ml濃度，以90y1/孔的體積加入96孔板中，同時(shí) 設(shè)置每孔加入90y1的0.1 M的磷酸氫二鈉溶液（pH9. 0)的空白對照組，以上各組樣品均設(shè) 置4個(gè)復(fù)孔；每孔加入10yIP-HPG (10mM)，混合均勾并調(diào)節(jié)pH值至9. 0,置于室溫并避 光靜置120min;使用酶標(biāo)儀在340nm處檢測各孔的OD值，根據(jù)下列公式計(jì)算HSA表面精氨 酸的酸酐化修飾率： 精氨酸修飾率（％)= [I- (OD MOnm樣品-OD !MOnm空白對照組均值）/ (OD MOnm 陰性對照組均值-OD 340nm空白對照組均值）]* 100。
[0025] 使用SigmaPlot軟件制作酸酐化修飾體系中HP的終濃度與HSA表面精氨酸的酸 酐化修飾率的對應(yīng)關(guān)系圖(如圖8所示)， 分別檢測上述各種HP酸酐修飾率的HSA樣品針對Zaire-PsV和Sudan-PsV假病毒的 進(jìn)入抑制作用；用CalcuSyn軟件計(jì)算不同HP酸酐修飾率的HSA蛋白抑制Ebola假病毒進(jìn) 入的半數(shù)抑制濃度（IC50值）和90%進(jìn)入抑制濃度（IC90值)，如表2所示。
[0026]表2
本發(fā)明所述的生物制劑具有阻斷Zaire型和Sudan型埃博拉病毒入侵細(xì)胞、阻止病毒 擴(kuò)大感染的作用，具有安全無毒副作用、穩(wěn)定性高、成本低廉等顯著優(yōu)勢，可用于開發(fā)成為 以其為主要活性成分的預(yù)防和控制埃博拉病毒感染的各種劑型，如溶液制劑、干粉制劑、噴 霧劑、搽洗劑或者盥洗劑，且制備和儲存方法簡單，尤其適用于非洲埃博拉流行疫區(qū)。
【附圖說明】
[0027] 圖1表示HP-HSA針對Zaire型埃博拉假病毒的進(jìn)入抑制曲線。
[0028] 圖2表示ML和SU酸酐化修飾的HSA針對Zaire型埃博拉假病毒的進(jìn)入抑制曲線。
[0029] 圖3表示三種酸酐化修飾的HSA針對Sudan型埃博拉假病毒的進(jìn)入抑制曲線。
[0030] 圖4表示HP- P -LG針對Sudan型埃博拉假病毒的進(jìn)入抑制曲線。
[0031] 圖5表不BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品曲線。
[0032] 圖6表示HP-HSA針對Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033] 圖7表示酸酐化反應(yīng)體系中HP終濃度與HSA的賴氨酸殘基修飾率的關(guān)系。
[0034] 圖8表示酸酐化反應(yīng)體系中HP終濃度與HSA的精氨酸殘基修飾率的關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0036] 實(shí)施例1 一種預(yù)防和控制多種基因型埃博拉病毒感染的生物制劑，采用如下方法制備： (1) 將3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)用二甲基亞砜（DMSO)配制成濃度為IM的母液； (2) 配制濃度為0.1 M的磷酸氫二鈉溶液（pH8. 5)，加入人血清白蛋白制成HSA溶液， HSA 濃度為 20mg/ml ; (3) 將步驟（1)中制備的酸酐溶液加入待修飾的HSA溶液中，使加入的酸酐終濃度為 12mM，充分混勻后，用4M NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至9. 0, 25°C孵育20min ; (4 )重復(fù)進(jìn)行步驟（3 )共五次，每次酸酐終濃度分別為12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即 最終使溶液中酸酐的終濃度為60mM，25°C孵育2h，完成酸酐化反應(yīng)； (5)將酸酐化蛋白溶液裝入截留量為7. 5KDa的透析袋中，置于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液 中透析換液（4°C)，共透析48h，中間更換透析外液一次，將完成換液的酸酐化蛋白溶液用 0. 45 y m微孔濾膜過濾，于4°C保存，即可按照常規(guī)方法制成各種劑型的成品。
[0037] 步驟（1)中所述的3-羥基-鄰苯二甲酸酐可以用馬來酸酐或者琥珀酸酐代替。
[0038] 實(shí)施例2 一種預(yù)防和控制多種基因型埃博拉病毒感染的生物制劑，采用如下方法制備： (1) 將馬來酸酐（ML)用二甲基亞砜（DMSO)配制成濃度為IM的母液； (2) 配制濃度為0.1 M的磷酸氫二鈉溶液（pH8. 5)，加入牛P -乳球蛋白 (0 -lactoglobulin，縮寫為 0 -LG)制成 0 -LG 溶液，0 -LG 濃度為 20mg/ml; (3) 將步驟（1)中制備的酸酐溶液加入待修飾的P -LG溶液中，使加入的酸酐終濃度為 12mM，充分混勻后，用4M NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至9. 0, 25°C孵育20min ; (4 )重復(fù)進(jìn)行步驟（3 )共五次，每次酸酐終濃度分別為12mM、24mM、36mM、48mM、60mM，即 最終使溶液中酸酐的終濃度為60mM，25°C孵育2h，完成酸酐化反應(yīng)； (5)將酸酐化蛋白溶液裝入截留量為7. 5KDa的透析袋中，置于pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液 中透析換液（4°C)，共透析48h，中間更換透析外液一次，將完成換液的酸酐化蛋白溶液用 0. 45 y m微孔濾膜過濾，于4°C保存，即可按照常規(guī)方法制成各種劑型的成品。
[0039] 步驟（1)中所述的馬來酸酐可以用3-羥基-鄰苯二甲酸酐或者琥珀酸酐代替。
[0040] 實(shí)施例3 一種預(yù)防和控制多種基因型埃博拉病毒感染的生物制劑，采用如下方法制備： (1) 將HP用二甲基亞砜（DMSO)配制成濃度為IM的母液； (2) 配制濃度為0.1 M