本發(fā)明涉及特別用于lc-ms（液相色譜-質(zhì)譜）分析的樣本基板、液體樣本分析裝置以及液體樣本的制備方法。本發(fā)明的應(yīng)用可用于例如液體樣本，特別是生物樣本的處理領(lǐng)域，例如蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

背景技術(shù)：

1、在本說明書中，參考了與本發(fā)明的背景技術(shù)相關(guān)，特別是與用于質(zhì)譜的細(xì)胞樣本制備相關(guān)的以下現(xiàn)有技術(shù)：

2、[1]?us?2019/0209592?a1；

3、[2]?h.?specht?et?al.?"single-cell?mass-spectrometry?quantifies?theemergence?of?macrophage?heterogeneity（單細(xì)胞質(zhì)譜法量化巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的出現(xiàn)）"doi:?http://dx.doi.org/10.1101/665307h；

4、[3]?y.?zhu?et?al.?"nanodroplet?processing?platform?for?deep?andquantitative?proteome?profiling?of?10–100?mammalian?cells（用于10-100個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的深度和定量蛋白質(zhì)組分析的納米液滴處理平臺(tái)）"?in?"nature?communications"(2018)?9:882,?doi:?10.1038/s41467-018-03367-w；

5、[4]?z.?y.?li?et?al.?"nanoliter-scale?oil-air-droplet?chip-basedsingle?cell?proteomic?analysis（基于納升級(jí)油-氣-液滴芯片的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析）"?in?"anal.?chem."?2018,?90,?5430?5438z；

6、[5]?us?2019/0250130?a1；

7、[6]?ep?3?964?290?a1；和

8、[7]?ep?4?075?145?a1。

9、眾所周知，人們越來越努力地研究蛋白質(zhì)組，特別是分析生物材料（如生物細(xì)胞或細(xì)胞聚集體或細(xì)胞成分）中包含的整套蛋白質(zhì)。可以使用各種基于抗體的技術(shù)和基于質(zhì)譜的技術(shù)來分析蛋白質(zhì)組，例如，質(zhì)譜流式（cytof）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離（maldi）、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜（scope-ms）、基于抗體的技術(shù)或液相色譜-質(zhì)譜（lc-ms）。后者在以高特異性檢測每個(gè)細(xì)胞中的大量蛋白質(zhì)的能力方面具有優(yōu)勢。

10、lc-ms通常包括以下過程。例如，使用熒光激活細(xì)胞分選儀（facs）分離生物細(xì)胞，并且對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞裂解，以提供細(xì)胞中包含的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)被酶消化成肽片段。在分析單個(gè)生物細(xì)胞的情況下，這些片段通常用用作質(zhì)量報(bào)告器的標(biāo)記分子，例如串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（tmt）標(biāo)記物來標(biāo)記，然后可選地進(jìn)行標(biāo)記淬滅（去除未結(jié)合的標(biāo)記分子）。在可選地匯集標(biāo)記后的樣本后，通過液相色譜法（lc）進(jìn)行肽片段的分離。將肽片段引入到串聯(lián)質(zhì)譜儀中，并且使用生物信息學(xué)技術(shù)通過肽指紋圖譜或串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。從分離細(xì)胞到匯集的樣本制備步驟在以下方面可能具有挑戰(zhàn)性：并行處理少量液體中包含的大量樣本、保持肽片段對(duì)某些樣本的分配以及避免不同樣本之間的交叉污染。

11、例如，在[1]至[4]中記載了用于樣本制備的當(dāng)前技術(shù)，這些技術(shù)使用相同的常規(guī)工作流程來進(jìn)行細(xì)胞分離、裂解、消化、tmt標(biāo)記和樣本收集，但是在樣本基板以及所應(yīng)用的用于裂解和消化的試劑的細(xì)節(jié)方面有所不同。根據(jù)[1]和[2]，在具有384個(gè)孔的微孔板中進(jìn)行裂解和消化，并且將標(biāo)記后的樣本收集到單個(gè)玻璃hplc（高效液相色譜）插入物中。根據(jù)[3]，使用自制的圖案化載玻片來進(jìn)行樣本制備。在[4]中，提出了使用油層來減少小液體樣本的蒸發(fā)，其中使用層堆疊體來創(chuàng)建樣本容器，并且使自支撐油膜橫跨在各樣本容器上方。在[6]中，公開了一種制備用于樣本分析的液體樣本的樣本制備裝置，其中具有反應(yīng)位點(diǎn)陣列的載體板裝置與具有收集容器的收集裝置相結(jié)合。各收集容器適于從至少兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)收集液體樣本，并且提供液體樣本以進(jìn)行樣本分析。在[7]中，記載了將收集裝置調(diào)整為直接定位在自動(dòng)取樣裝置（如液相色譜自動(dòng)取樣裝置）的轉(zhuǎn)盤中。

12、使用常規(guī)基板，如384孔板、圖案化載玻片、層堆疊體、[6]中的樣本制備裝置或[7]中的收集裝置，具有以下缺點(diǎn)。首先，384孔板適于處理在高達(dá)100?μl范圍內(nèi)的相對(duì)較大的體積。此外，基板需要復(fù)雜的蓋子處理以使蒸發(fā)最小化。作為另一缺點(diǎn)，將標(biāo)記后的片段從孔轉(zhuǎn)移到玻璃hplc插入物或任何其他常見的收集容器是很耗時(shí)的，包括引入污染物的風(fēng)險(xiǎn)，并且容易出錯(cuò)。例如，根據(jù)[1]，使用耗時(shí)的逐一移液來進(jìn)行轉(zhuǎn)移任務(wù)。此外，特別地，圖案化載玻片是專用裝置，不適于工藝鏈的所有步驟，包括另外的先前樣本處理步驟，如細(xì)胞分離。[4]中使用的層堆疊體具有復(fù)雜且昂貴的結(jié)構(gòu)。雖然[6]和[7]在樣本匯集和將樣本轉(zhuǎn)移到液相色譜自動(dòng)取樣裝置方面引入了一些改進(jìn)，但lc-ms分析仍存在局限性。通常，常規(guī)技術(shù)不足以適應(yīng)樣本制備的自動(dòng)化，導(dǎo)致在與人互動(dòng)的耗時(shí)過程和污染風(fēng)險(xiǎn)方面存在局限性。

13、因此，常規(guī)技術(shù)的一個(gè)顯著的特別缺點(diǎn)是，制備的樣本必須手動(dòng)轉(zhuǎn)移到樣本筒，以執(zhí)行l(wèi)c-ms樣本分析。例如，商用evotips?（例如，參見[5]）必須手動(dòng)裝載樣本。這意味著，將通過任何樣本制備方法制備的樣本裝載到evotips?上的步驟總是包括耗時(shí)的移液步驟。另外，樣本與移液管尖端的壁接觸，這可能會(huì)導(dǎo)致待分析樣本中一些肽的吸附損失。

14、上述問題不僅發(fā)生在制備用于質(zhì)譜分析的樣本中，也發(fā)生在通過將試劑應(yīng)用于多個(gè)樣本并處理樣本來制備用于樣本分析的液體樣本的其他任務(wù)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的

2、本發(fā)明的目的是提供一種特別用于lc-ms的改進(jìn)的樣本基板、液體樣本分析裝置以及液體樣本的制備方法，它們能夠避免常規(guī)技術(shù)的缺點(diǎn)或局限。特別地，樣本制備應(yīng)具有促進(jìn)樣本制備和分析的多路復(fù)用、減少操作時(shí)間、處理低至納升（nl）范圍的減少的樣本體積、最小化或避免蒸發(fā)問題和/或促進(jìn)樣本匯集的能力。根據(jù)進(jìn)一步的方面，樣本基板應(yīng)配置為盡可能用戶友好和/或適于樣本制備的整個(gè)工藝鏈，特別是lc-ms分析，例如，使得樣本制備能夠自動(dòng)化。

3、發(fā)明概述

4、上述目的分別通過包括獨(dú)立權(quán)利要求特征的樣本基板、液體樣本分析裝置和樣本制備方法來解決。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例和應(yīng)用的特征在從屬權(quán)利要求中定義。

5、根據(jù)本發(fā)明的第一總體方面，上述目的通過樣本基板來解決，所述樣本基板適于制備用于lc-ms分析（例如，蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析）的樣本。所述樣本基板包括具有多個(gè)容器（例如，孔或更復(fù)雜的容器或容納空間陣列）的反應(yīng)基板裝置。（所述多個(gè)容器中的）各容器具有至少一個(gè)配置為容納液體樣本，優(yōu)選樣本液滴的容納空間（或子容器、子孔）。各容器還具有帶容器開口的容器連接部。

6、所述樣本基板還包括多個(gè)收集筒。（所述多個(gè)收集筒中的）各收集筒具有帶筒開口的筒連接部。各收集筒配置為容納來自一個(gè)容器的液體樣本。各個(gè)收集筒優(yōu)選地具有移液管尖端和/或圓錐和/或立柱的形狀，特別地在端面處具有單個(gè)開口（即，筒開口）。優(yōu)選地，收集筒是商用evotips?（例如，參見[5]）或形狀與evotips?匹配的筒。evotips?是一次性補(bǔ)集柱（trap?column），因?yàn)閷⑾疵撆c液相色譜相結(jié)合可以省去幾個(gè)樣本處理步驟，并減少注入周期開銷，因此其可加快樣本裝載速度并且顯著減少殘留，從而簡化工作流程。

7、優(yōu)選地，收集筒是一體式部件。特別地，筒連接部優(yōu)選地是收集筒其余部分的組成部分?；蛘撸占灿啥鄠€(gè)部分制成，例如筒體和固定到所述筒體的筒連接部。

8、優(yōu)選地，收集筒（也稱為stage?tips）是尖形容器，特別優(yōu)選地由惰性聚合物材料制成，例如c18材料，以例如在注入到色譜分離柱中之前獲得脫鹽/清潔蛋白質(zhì)消化樣本的優(yōu)點(diǎn)，已知惰性聚合物材料通常具有聚合物非極性封端和高碳含量。

9、根據(jù)本發(fā)明，各容器連接部通過形狀配合與各筒連接部匹配，使得它們適于（特別地，液密）連接反應(yīng)基板裝置和多個(gè)收集筒，從而經(jīng)由反應(yīng)基板裝置和多個(gè)收集筒的開口提供容器和收集筒的直接液體連通。優(yōu)選地，各容器連接部和各筒連接部適于直接相互連接。優(yōu)選地，容器連接部和筒連接部彼此接觸的接觸區(qū)域具有圓形（round），特別地環(huán)形（circular）或橢圓形的橫截面形狀。

10、特別地，樣本基板能夠?qū)崿F(xiàn)容器和收集筒的1對(duì)1連接。換言之，樣本基板適于實(shí)現(xiàn)（恰好）一個(gè)容器和（恰好）一個(gè)收集筒的（單獨(dú)）連接，特別地經(jīng)由相應(yīng)的容器連接部和筒連接部。該連接在（恰好）一個(gè)容器和（恰好）一個(gè)收集筒之間提供直接液體連通。因此，在一個(gè)容器中制備的一個(gè)或多個(gè)樣本只能轉(zhuǎn)移到一個(gè)收集筒。

11、術(shù)語“連接部”通常是指當(dāng)與具有互補(bǔ)形狀的另一連接部連接時(shí)，提供露出的接合形狀，特別是具有固有液密性的地形結(jié)構(gòu)特征（或元件）。反應(yīng)基板裝置的各連接部，特別是一個(gè)容器的提供容器開口的敞口端部與連接部，特別是一個(gè)收集筒的提供筒開口的敞口端部匹配。

12、有利地，即使在例如通過離心的樣本轉(zhuǎn)移期間，連接部也會(huì)額外提供容器和收集筒的機(jī)械連接。可選地，容器和收集筒的機(jī)械連接還可以通過離心裝置的設(shè)計(jì)來支持和/或通過固定元件來支持，該離心裝置將容器和收集筒保持在一起，該固定元件在容器和收集筒的連接狀態(tài)下在其之間提供額外的夾緊和/或螺紋連接。

13、根據(jù)本發(fā)明的第二總體方面，上述目的通過液體樣本分析裝置來解決，所述液體樣本分析裝置適于制備用于lc-ms樣本分析（例如，蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析）的樣本并且執(zhí)行l(wèi)c-ms樣本分析，而且包括根據(jù)本發(fā)明第一總體方面或其實(shí)施例的樣本基板和lc-ms裝置。

14、根據(jù)本發(fā)明的第三總體方面，上述目的通過執(zhí)行l(wèi)c-ms樣本分析（例如，蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析）的方法來解決，其中采用根據(jù)本發(fā)明第一總體方面或其實(shí)施例的樣本基板和lc-ms裝置。該方法包括在樣本基板的容器中收集待分析的樣本，在容器中對(duì)（收集的）樣本進(jìn)行分解反應(yīng)，以及將各收集筒與一個(gè)容器連接（優(yōu)選地，在樣本處理之后）。該方法還包括將分解后的樣本從各個(gè)容器轉(zhuǎn)移（例如，匯集）到連接的收集筒，將收集筒與容器分離，然后將收集筒與lc-ms裝置連接，以及使用lc-ms裝置進(jìn)行l(wèi)c-ms樣本分析。

15、在執(zhí)行該方法時(shí)，樣本基板，特別是反應(yīng)基板裝置，可以布置在兩個(gè)不同的位置（相對(duì)于重力的取向）處。特別地，當(dāng)收集樣本、對(duì)樣本進(jìn)行分解反應(yīng)并且將收集筒連接到容器時(shí)，反應(yīng)基板裝置布置在第一位置處，其中容器布置在反應(yīng)基板裝置的頂側(cè)和/或容器開口朝上，即面向與重力方向相反的方向。在轉(zhuǎn)移分解后的樣本之后并且可選地已經(jīng)在轉(zhuǎn)移期間，將樣本基板布置在第二位置處，其中容器布置在反應(yīng)基板裝置的下側(cè)和/或容器開口朝下，即面向重力方向。優(yōu)選地，通過將樣本基板倒置，將樣本基板從第一位置移動(dòng)到第二位置。在第二位置處，分解后的樣本能夠通過重力作用從容器流到（連接的）收集筒。優(yōu)選地，通過離心進(jìn)一步支持這種樣本轉(zhuǎn)移。

16、優(yōu)選地，使用樣本基板制備和分析的樣本包括生物材料，特別是生物細(xì)胞、細(xì)胞群和/或細(xì)胞成分。例如，生物材料可以是一個(gè)單細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞或源自組織切片（諸如新鮮冷凍組織或石蠟包埋ftpe（含氟熱塑性彈性體）組織切片）的至少一塊生物材料。另外，分解反應(yīng)優(yōu)選地包括細(xì)胞裂解和/或蛋白質(zhì)消化。例如，添加試劑，使得樣本細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)消化成肽片段。

17、本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。在通過lc-ms方法（質(zhì)譜法）進(jìn)行后續(xù)分析之前，可以使用樣本基板來執(zhí)行樣本制備方案的所有步驟。特別地，樣本基板使得在容器中制備的樣本能夠直接并且優(yōu)選地自動(dòng)轉(zhuǎn)移（例如，匯集）到諸如evotips?等收集筒，從而從工作流程中排除了使用額外的輔助移液管和/或移液步驟以在將制備的樣本引入到分析裝置中，特別是lc-ms裝置中之前進(jìn)行轉(zhuǎn)移。消除移液步驟將減少通常在移液管的壁上發(fā)生的肽損失。特別是對(duì)于針對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析制備的單細(xì)胞或少量細(xì)胞（例如，蛋白質(zhì)）樣本，其中樣本量（sample?size）通常已很低（通常<ng），采用根據(jù)本發(fā)明的樣本基板提供了從各樣本中檢測到蛋白質(zhì)的數(shù)量增加。

18、作為其他優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)手動(dòng)技術(shù)相比，將在容器中制備的樣本直接轉(zhuǎn)移到收集筒會(huì)導(dǎo)致更加速的轉(zhuǎn)移。另外，容器中用于樣本制備（樣本反應(yīng)）的樣本體積（“反應(yīng)體積”）可以根據(jù)應(yīng)用條件減小，減小到樣本體積低于1?μl，特別地低于100?nl，例如減小到1?nl甚至更低。制備之后，在經(jīng)由離心進(jìn)行轉(zhuǎn)移之前，可以通過稀釋步驟將樣本體積增加到例如1?μl至10?μl（“轉(zhuǎn)移體積”）?？梢詼p小容器的尺寸，從而便于樣本基板的處理并且便于防止蒸發(fā)的措施。通過將容器分配給收集筒，可以支持樣本制備的多路復(fù)用。作為其他優(yōu)點(diǎn)，樣本基板可以例如由低成本塑料材料容易地制造，和/或可以作為一次性使用或可重復(fù)使用的消耗品來提供和使用。

19、進(jìn)一步有利地，本發(fā)明的應(yīng)用可以制備用于各種類型的樣本分析的多個(gè)液體樣本。例如，多個(gè)單細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞和/或細(xì)胞成分可以布置在各個(gè)反應(yīng)容器中?？梢灾苽錁颖?，以例如用于后續(xù)的質(zhì)譜分析，可選地與樣本成分的液相色譜分離相結(jié)合，和/或用于其他分析，例如包括測序測量的基因組分析。

20、另外，根據(jù)本發(fā)明的樣本基板可以結(jié)合在各種樣本收集裝置中，以減少所需的手動(dòng)操作次數(shù)并且提高例如蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜結(jié)果的質(zhì)量/靈敏度。例如，樣本基板可以與在[7]中公開的樣本收集裝置（也稱為proteochip）結(jié)合使用。

21、根據(jù)本發(fā)明的可選變型，容器可以排列成矩陣和/或陣列，其中容器彼此隔開。容器的數(shù)量和排列的類型可以根據(jù)要獲得的樣本處理的并行度來選擇，例如，根據(jù)要應(yīng)用的不同標(biāo)記分子的數(shù)量來選擇。另外，反應(yīng)容器的形狀可以根據(jù)例如樣本制備裝置的應(yīng)用條件和應(yīng)用的樣本液體處理技術(shù)來選擇。

22、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，各筒連接部與lc-ms裝置的樣本輸入部的形狀匹配。有利地，在樣本已經(jīng)從容器轉(zhuǎn)移到收集筒之后，可以從反應(yīng)基板裝置上移除收集筒，并且直接放置在lc-ms裝置中，而不需要進(jìn)一步將樣本轉(zhuǎn)移到其他容器以執(zhí)行l(wèi)c-ms分析。例如，在使用evotips?作為收集筒的情況下，evotips?能夠直接與evosep?液相色譜系統(tǒng)連接，以進(jìn)行質(zhì)譜分析。

23、根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，容器連接部和筒連接部中的一者分別由在容器的容器開口或收集筒的筒開口處的突出邊緣形成，并且容器連接部和筒連接部中的另一者分別由在容器開口或筒開口處的內(nèi)壁部提供。當(dāng)連接時(shí)，突出邊緣和內(nèi)壁部直接接觸，例如，其中內(nèi)壁部包圍突出邊緣。邊緣和內(nèi)壁的連接組合在集成到反應(yīng)基板裝置的材料中，特別是容器和收集筒中方面，以及特別是在塑料材料之間的可靠液密連接方面具有特別的優(yōu)勢。優(yōu)選地，邊緣具有截圓錐形狀。

24、特別優(yōu)選地，所述突出邊緣具有圓錐形形狀。有利地，圓錐形進(jìn)一步便于容器連接部和筒連接部的簡化連接。

25、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選變型（以下：本發(fā)明的第一實(shí)施例或單板實(shí)施例），反應(yīng)基板裝置包括具有多個(gè)容器的單板。容器可以在單板內(nèi)形成為孔。因此，反應(yīng)基板裝置可以是孔板，其中各孔設(shè)置有一個(gè)容器連接部。這種單板實(shí)施例特別優(yōu)選用于制備包含無標(biāo)記反應(yīng)的樣本。

26、根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選變型（以下：本發(fā)明的第二實(shí)施例或雙板實(shí)施例），反應(yīng)基板裝置包括兩個(gè)板的堆疊體，這兩個(gè)板包括載體板和漏斗板。所述載體板包括容器的至少兩個(gè)容納空間的多個(gè)陣列，其中各陣列具有帶容器部開口的載體板連接部。所述漏斗板包括多個(gè)漏斗形開口通道，其中各漏斗形開口通道包括第一端和提供一個(gè)容器連接部的第二端，該第一端具有帶漏斗連接開口的漏斗連接部。載體板連接部和漏斗連接部通過形狀配合彼此匹配，使得它們適于（特別地，液密）連接載體板和漏斗板，從而形成多個(gè)容器，各容器由彼此連接并且經(jīng)由容器部開口和漏斗連接開口直接液體連通的一個(gè)所述至少兩個(gè)容納空間的陣列和一個(gè)漏斗形開口通道組成。利用第二實(shí)施例，各容器由一個(gè)容納空間陣列與一個(gè)漏斗形開口通道相結(jié)合來提供。

27、包括載體板和漏斗板的堆疊體的雙板實(shí)施例特別優(yōu)選用于制備包含多路反應(yīng)（multiplexed?reaction）的樣本。例如，載體板可以對(duì)應(yīng)于在[6]（其通過引用并入本文）中公開的載體板裝置，特別是在載體板裝置的形狀、尺寸和使用方法方面。

28、第二實(shí)施例的一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)由反應(yīng)基板在容納樣本和匯集樣本方面的雙重功能提供。使用漏斗板，可以將在陣列的不同容納空間中分別制備的多個(gè)樣本匯集到共用的收集筒中。

29、根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，樣本基板可以包括以下特征中的至少一者。容器的體積在100?nl至10?μl的范圍內(nèi)。收集筒的體積在10?μl至1?ml的范圍內(nèi)。容器連接部和筒連接部中的一者的內(nèi)徑等于容器連接部和筒連接部中的另一者的外徑。容器連接部和筒連接部中的一者的內(nèi)徑在1?mm至10?mm的范圍內(nèi)，并且容器連接部和筒連接部中的另一者的外徑在1?mm至10?mm的范圍內(nèi)。樣本基板和/或整個(gè)反應(yīng)基板裝置由玻璃、塑料、硅、聚四氟乙烯、聚丙烯和/或聚碳酸酯制成。反應(yīng)基板裝置的所有部件可以由相同材料制成，或者不同的部件可以由不同的材料制成。

30、優(yōu)選地，在采用突出的容器連接部的情況下，在1?mm至10?mm，特別地2?mm至10?mm的范圍內(nèi)選擇容器連接部的縱向長度（高度）。有利地，利用這些參數(shù)特別地改善了在離心期間連接部的穩(wěn)定連接。

31、上述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例、變型和特征可以根據(jù)需要彼此組合。在樣本基板及其實(shí)施例的上下文中公開的特征也代表了本發(fā)明方法及其實(shí)施例的優(yōu)選特征，反之亦然。因此，上述方面以及發(fā)明和優(yōu)選特征，特別是關(guān)于方法的執(zhí)行的方面以及發(fā)明和優(yōu)選特征，也適用于樣本基板。