鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素藥物方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕 霉素藥物方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 目前醫(yī)用種植體材料中，鈦合金材料應(yīng)用最為廣泛，與其他材料相比，其具有高強(qiáng) 度、高韌性、耐腐蝕的優(yōu)點(diǎn)。醫(yī)用鈦合金種植體的表面形貌對細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互聯(lián) 系起著重要的作用，對種植體-骨結(jié)合的發(fā)生起著關(guān)鍵的作用。越來越多的處理方法被應(yīng) 用于種植體表面，例如大顆粒噴砂、酸蝕、激光蝕刻等，這些方法得到的表面形貌大多在微 米級，主要通過機(jī)械嵌合作用增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能，進(jìn)而促進(jìn)種植體-骨結(jié)合，如今微米形 貌已經(jīng)被廣泛研宄并應(yīng)用于臨床領(lǐng)域。然而有研宄表明微米級表面形貌在促進(jìn)成骨細(xì)胞分 化的同時(shí)，也抑制了成骨細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致較少的骨生成量，最終影響種植體-骨結(jié)合的效 果。
[0003] 隨著種植體表面處理技術(shù)的進(jìn)步，納米級形貌與細(xì)胞間關(guān)系的研宄已成為相關(guān)領(lǐng) 域研宄的熱點(diǎn)。羥基磷灰石（Hydroxyapatite, HAp)是一種與人體硬組織成份類似的生物 活性陶瓷材料，具有良好的生物相容性、生物活性和骨傳導(dǎo)性，HAp在植入體內(nèi)后可以和人 體自然骨形成牢固的化學(xué)鍵結(jié)合，相態(tài)穩(wěn)定，安全無毒，同時(shí)對組織無刺激和排斥作用。隨 著納米技術(shù)的發(fā)展和推廣，納米級HAp成為現(xiàn)在研宄的熱點(diǎn)之一：納米級HAp較普通型有更 強(qiáng)的生物活性；更加有利于改善骨植入體的力學(xué)性能；更有利于骨組織的整合，同時(shí)骨傳 導(dǎo)性能、溶解性能和力學(xué)性能也有所提高；對有機(jī)生命體不存在物理損傷；有負(fù)載藥物并 緩釋的作用；另外還對腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。
[0004] 雷帕霉素是一種常用抗腫瘤藥物，研宄表明對成骨，尤其是成骨早期有一定促進(jìn) 成骨分化作用，負(fù)載于納米級HAp上可以緩釋局部形成穩(wěn)定濃度，達(dá)到促進(jìn)成骨的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕 霉素藥物的方法。
[0006] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素的方法，包括如下步驟：
[0008] 1)預(yù)處理：將鈦種植體打磨拋光，分別用水和乙醇超聲清洗、吹干備用；
[0009] 2)酸蝕：將上述鈦種植體用不同的酸進(jìn)行二次酸蝕，清洗烘干；
[0010] 3)堿熱：將上述鈦種植體于預(yù)定溫度下進(jìn)行堿熱處理，清洗烘干，得活化后鈦種 植體；
[0011] 4) HAp礦化：采用Kokubo礦化法在活化后鈦種植體上沉積羥基磷灰石，制備鈦/ 羥基磷灰石復(fù)合涂層；
[0012] 5)雷帕霉素載入：用雷帕霉素溶液對上述鈦/羥基磷灰石復(fù)合涂層進(jìn)行超聲浸漬 處理，制得負(fù)載雷帕霉素的鈦材。
[0013] 優(yōu)選的是，步驟1)中，所述的鈦種植體為鈦片或鈦棒。
[0014] 優(yōu)選的是，步驟2)中，所述酸蝕的具體步驟為：將鈦種植體放入摩爾比為 0. 11:0. 09的氫氟酸和硝酸混合溶液中，室溫下處理lOmin，清洗干凈；然后，將其放入摩爾 比為2. 9:4. 5的鹽酸和硫酸混合液中，80°C下酸蝕20min ;最后，將上述處理的鈦種植體放 到體積比為1:1的98wt %的H2SOjP 30wt %的H 202混合溶液中，室溫下處理60min，水洗、 吹干。
[0015] 優(yōu)選的是，步驟3)中，所述堿熱處理?xiàng)l件為：100°C下反應(yīng)24h。
[0016] 優(yōu)選的是，步驟4)的具體操作步驟為：制備simulated body fluid(SBF)礦 化液，所述礦化液的成份為NaCl 8. 035重量份，NaHCO3 0.355重量份，KCl 0.225重量 份，K2HPO4 · 3H20 0· 231 重量份，HCl L 4235 重量份，CaCl2O. 292 重量份，Na2SO4, 0· 072 重 量份，Tris 6. 118重量份，HCl 0-1. 825重量份；并按照樣品暴露面積Vs/SBF = 10的比例 加入SBF，礦化時(shí)間為2-4周，取出，冷凍干燥，備用。
[0017] 優(yōu)選的是，步驟5)的具體步驟為：將雷帕霉素溶液加入盛有鈦/羥基磷灰石復(fù)合 涂層的培養(yǎng)孔板中，浸沒，在超聲清洗機(jī)中超聲IOs后，置于室溫裝載12h，取出后PBS沖洗 3次，自然風(fēng)干后，重新浸入雷帕霉素溶液中，整個(gè)過程重復(fù)3次，最后干燥后得到負(fù)載雷帕 霉素的鈦材。
[0018] 優(yōu)選的是，所述雷帕霉素溶液的濃度為10mg/mL。
[0019] 上述任一的鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素的方法制備的負(fù)載 雷帕霉素的欽材。
[0020] 上述的負(fù)載雷帕霉素的鈦材在制備生物活性材料中的應(yīng)用。
[0021] 上述的負(fù)載雷帕霉素的鈦材在制備人造骨骼中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 1.本發(fā)明的方法為：鈦+酸蝕+堿熱+HAp涂層+藥物，一方面，HAp涂層的礦化方 式不同，酸蝕+堿熱更利于Kokubo法中礦化液的沉積及礦化；另一方面，首次將雷帕霉素負(fù) 載于材料促進(jìn)成骨，獲得了顯著地效果，亦為本方法的最大創(chuàng)新。
[0024] 2.本發(fā)明各處理步驟的優(yōu)點(diǎn)：
[0025] 預(yù)處理：建立鈦種植體表面處理的基礎(chǔ)條件。
[0026] 酸蝕：是對鈦種植體表面的粗處理，一方面可以去除表面污染物，獲得清潔和均勻 的表面，二是可以獲得微米級的粗糙結(jié)構(gòu)和納米級孔洞，這些微納復(fù)合結(jié)構(gòu)可以為后續(xù)的 堿熱處理和HAp礦化提供一個(gè)有利于離子聚集和成核的微環(huán)境，促進(jìn)HAp涂層在鈦片表面 快速生成。微納結(jié)構(gòu)的存在增大了鈦片的比表面積，為礦化涂層的生成提供了更多的黏附 位點(diǎn)。
[0027] 堿熱：是對鈦種植體表面的細(xì)處理，在酸蝕微納結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成更多納米級結(jié)構(gòu)， 其有利于HAp的礦化。
[0028] HAp礦化：酸蝕和堿熱作為HAp礦化的預(yù)處理，在鈦片表面生成微納復(fù)合結(jié)構(gòu)，提 高了鈦片的表面能，為礦化涂層的生成提供一個(gè)有利的條件。相對于酸蝕和堿熱，納米級 HAp與骨有更佳的生物相容性；Kokubo法中礦化液模擬了人體血漿的各種成份比例，預(yù)實(shí) 驗(yàn)表明在單純酸蝕或單純堿熱的鈦種植體表面，礦化效果差，但酸蝕+堿熱后礦化效果佳。
[0029] 雷帕霉素：相對于酸蝕和堿熱，納米級HAp涂層有更強(qiáng)的負(fù)載并緩釋藥物的作用， 雷帕霉素有著潛在的促進(jìn)成骨作用（但未被廣泛研宄及報(bào)道），該方法的推廣必將加速其 作用機(jī)制的研宄。
【附圖說明】
[0030] 圖1本發(fā)明制備流程圖
[0031] 圖2各種處理鈦片表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。酸蝕后的鈦片表面形成了微米級的溝壑樣外 貌，堿熱使鈦片表面形成大量納米級凹坑外貌及納米花三維結(jié)構(gòu)（利于HAp礦化）外貌，酸 蝕+堿熱鈦片表面相對單獨(dú)堿熱生成了更多的納米花結(jié)構(gòu)。
[0032] 圖3MC3T3細(xì)胞成骨分化因子（Collagen I、OCN、Runx2)mRNA表達(dá)，在HAp礦化組 明顯高于其他對照組。
[0033] 圖4HAp涂層鈦片與鈦棒，表面成份定性為HAp
[0034] 圖5種植手術(shù)步驟
[0035] 圖6影像學(xué)觀察種植體和BIC
[0036] 具體的實(shí)施方式 [0037] 實(shí)施例1
[0038] 羥基磷灰石（HAp)在光滑鈦合金表面的礦化能力較差，流程（見圖1)為首先利用 酸蝕和水熱氧化技術(shù)在光滑鈦合金表面形成有利于納米級HAp礦化的微納結(jié)構(gòu)（包括微米 級溝壑、納米級凹坑和三維納米花結(jié)構(gòu)，見圖2)，再利用Kokubo礦化技術(shù)實(shí)現(xiàn)HAp在鈦材的 礦化。具體步驟為：
[0039] 預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)使用TC4鈦合金，TC4的化學(xué)成分見表1。將線切割之后的鈦片（長 10mm，寬10mm，高2mm)備用于體外實(shí)驗(yàn)，鈦棒（長4mm，直徑2mm)備用于體內(nèi)試驗(yàn)；經(jīng)600#， 800#，1200#砂紙打磨后，用絨布拋光，將拋光之后的樣品放入水和無水乙醇中分別超聲清 洗15min，吹干備用。
[0040]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素藥物方法，其特征在于，包括 如下步驟： 1) 預(yù)處理：將鈦種植體打磨拋光，分別用水和乙醇超聲清洗、吹干備用； 2) 酸蝕：將上述鈦種植體用不同的酸進(jìn)行二次酸蝕，清洗烘干； 3) 堿熱：將上述鈦種植體于預(yù)定溫度下進(jìn)行堿熱處理，清洗烘干，得活化后鈦種植體； 4. HAp礦化：采用Kokubo礦化法在活化后鈦種植體上沉積羥基磷灰石，制備鈦/羥基 磷灰石復(fù)合涂層； 5) 雷帕霉素載入：用雷帕霉素溶液對上述鈦/羥基磷灰石復(fù)合涂層進(jìn)行超聲浸漬處 理，制得負(fù)載雷帕霉素的鈦材。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述的鈦種植體為鈦片或鈦棒。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述酸蝕的具體步驟為：將鈦種 植體放入摩爾比為0. 11:0. 09的氫氟酸和硝酸混合溶液中，室溫下處理lOmin，清洗干凈； 然后，將其放入摩爾比為2. 9:4. 5的鹽酸和硫酸混合液中，80°C下酸蝕20min ;最后，將上述 處理的鈦種植體放到體積比為1:1的98wt %的H2SOjP 30wt %的H 202混合溶液中，室溫下 處理60min，水洗、吹干。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述堿熱處理?xiàng)l件為：100°C下 反應(yīng)24h。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)的具體操作步驟為：制備礦化液，并 按照樣品暴露面積Vs/SBF = 10的比例加入SBF，礦化時(shí)間為2-4周，取出，冷凍干燥，備用。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述礦化液的成份為NaCl 8. 035重量 份，NaHCO3O. 355 重量份，KCl 0· 225 重量份，K2HPO4 ·3Η20 0· 231 重量份，HCl L 4235 重量 份，CaCl2O. 292 重量份，Na2SO4, 0. 072 重量份，Tris 6. 118 重量份，HCl 0-1. 825 重量份。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)的具體步驟為：將雷帕霉素溶液加 入盛有鈦/羥基磷灰石復(fù)合涂層的培養(yǎng)孔板中，浸沒，在超聲清洗機(jī)中超聲IOs后，置于室 溫裝載12h，取出后PBS沖洗3次，自然風(fēng)干后，重新浸入雷帕霉素溶液中，整個(gè)過程重復(fù)3 次，最后干燥后得到負(fù)載雷帕霉素的鈦材。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述雷帕霉素溶液的濃度為10mg/mL。
9. 權(quán)利要求1-8所述的鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素的方法制備 的負(fù)載雷帕霉素的欽材。
10. 權(quán)利要求9所述的負(fù)載雷帕霉素的鈦材在制備人造骨骼中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了鈦材表面制備納米級羥基磷灰石層負(fù)載雷帕霉素藥物方法，包括如下步驟：1)預(yù)處理：將鈦種植體打磨拋光，分別用水和乙醇超聲清洗、吹干備用；2)酸蝕：將上述鈦種植體用不同的酸進(jìn)行二次酸蝕，清洗烘干；3)堿熱：將上述鈦種植體于預(yù)定溫度下進(jìn)行堿熱處理，清洗烘干，得活化后鈦種植體；4)HAp礦化：采用Kokubo礦化法在活化后鈦種植體上沉積羥基磷灰石，制備鈦/羥基磷灰石復(fù)合涂層；5)雷帕霉素載入：用雷帕霉素溶液對上述鈦/羥基磷灰石復(fù)合涂層進(jìn)行超聲浸漬處理，制得負(fù)載雷帕霉素的鈦材。該制備方法操作簡單、產(chǎn)率高、易于大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】A61L27-06, A61L27-32, A61L27-54
【公開號】CN104707170
【申請?zhí)枴緾N201510155416
【發(fā)明人】劉超, 張東, 萬熠, 劉宏, 劉少華, 董建勇, 王滕, 張蕊, 馬保金
【申請人】山東大學(xué)齊魯醫(yī)院
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月2日